Caspase的分類、特點及在細胞凋亡中的作用機制

Caspase家族簡介：
Caspase家族是一組存在于細胞質中的蛋白酶，它們在程序性細胞死亡（如細胞凋亡）和炎癥過程中扮演重要角色。Caspase是“含半胱氨酸的天冬氨酸特異性蛋白酶”（Cysteine-dependent Aspartate-directed proteASEs）的縮寫，其活性位點含有半胱氨酸，并能特異性地切割靶蛋白天冬氨酸殘基后的肽鍵。

Caspase家族

Caspase家族成員：
Caspases根據其功能可以分為炎癥caspase和凋亡caspase：

炎癥caspase：包括Caspase-1、-4、-5和-11，這些酶主要參與炎癥反應中白介素前體的活化，而不是直接參與細胞凋亡信號的轉導；

凋亡caspase：主要參與細胞凋亡，又可以分為起始caspase,如caspase-2、-8、-9、-10，負責對效應caspase的前體進行切割，產生有效應作用的caspase。

效應caspases：caspase-3、-6、-7，負責切割細胞核內、細胞質中結構蛋白和調節蛋白，使其失活或者活化。

凋亡相關caspase的特點：

激活機制
自我剪切激活：許多caspase以非活性的前體形式存在，需要特定的刺激或與其他分子相互作用進行自我剪切才能激活。例如，caspase-8和caspase-9在與特定的適配器蛋白結合形成復合物時被激活。

級聯反應：一旦起始caspase被激活，它會進一步激活更多的效應caspase，形成一個放大信號的級聯反應。這種機制確保了細胞凋亡是一個不可逆的過程。

底物特異性
Caspase對底物具有高度特異性，通常識別四肽序列中的天冬氨酸殘基，并在此位置進行切割。不同的caspase偏好不同的切割位點，這決定了它們的具體功能。效應caspase能夠切割多種細胞內蛋白，如核纖層蛋白、聚ADP核糖聚合酶(PARP)等，導致細胞骨架破壞、DNA片段化以及細胞膜改變等特征性變化。

結構特點
所有caspase都包含一個大的催化亞基和一個小的調節亞基，這兩個亞基共同構成異二聚體。每個亞基又由多個功能域組成，如CARD(Caspase Recruitment Domain)、DD(Death Domain)等，這些結構域參與了caspase的激活及其與其它蛋白質的相互作用。

調控機制
在正常情況下，caspase以前體形式存在于細胞中，受到嚴格調控。只有當細胞接收到特定的死亡信號時，才會解除抑制，允許caspase激活。一些抑制劑如IAPs(Inhibitor of Apoptosis Proteins)可以通過直接結合caspase來阻止其活性，從而抑制細胞凋亡。

Caspase的活化
Caspase的激活過程可以分為同源活化(Homotypic activation)和異源活化(Heterotypic activation)，這兩種機制在細胞凋亡過程中起著至關重要的作用。下面詳細解釋這兩種激活方式及其特點。

Caspase的活化

1、同源活化(Homotypic activation)
同源活化指的是caspase分子通過相互作用形成二聚體或多聚體，從而實現自我剪切和激活的過程。這一過程通常涉及caspase前體(procaspase)之間的相互作用。在同源活化中，未活化的procaspase通過其特定結構域（如CARD或DD）與另一個procaspase相互作用，形成同源二聚體或多聚體復合物。這種聚合狀態改變了procaspase的構象，使其能夠進行自我剪切，去除抑制性區域，暴露出活性位點，最終形成具有催化活性的成熟caspase。

如Caspase-9：在線粒體途徑中，細胞色素c從線粒體釋放到細胞質后，與Apaf-1結合形成凋亡小體(apoptosome)。這個復合體募集多個procaspase-9分子，促使它們發生同源活化；

Caspase-8：在外源性途徑中，當死亡受體與其配體結合并招募接頭蛋白形成DISC（死亡誘導信號復合物）時，procaspase-8在DISC內通過相互作用發生同源活化。

2、異源活化(Heterotypic activation)
異源活化則是指不同類型的蛋白質或caspase家族成員之間通過相互作用促進彼此的激活。這類激活通常需要其他輔助因子或適配器蛋白的參與。在異源活化中，一個procaspase與其他非caspase蛋白質相互作用，這些蛋白質可能作為激活劑或支架幫助procaspase定位和構象改變。例如，某些適配器蛋白可以通過提供特定的結合界面，促進procaspase的聚集和構象變化，從而促進其自我剪切和激活。

如Caspase-3和Caspase-7：雖然它們主要作為效應caspase直接由起始caspase激活，但有時也需要特定的支架蛋白或其他調控分子的幫助來完成完全激活；

Bid蛋白：在內源性途徑中，caspase-8不僅可以直接激活下游的效應caspase，還可以切割Bid蛋白生成tBid，后者遷移到線粒體上，進一步放大凋亡信號，間接促進了其他caspase的激活。

同源活化依賴于procaspase間的直接相互作用，形成同源二聚體或多聚體以促進自我剪切和激活，常見于起始caspase如caspase-8和caspase-9的激活過程中。異源活化則涉及不同蛋白質之間的相互作用，其中一些蛋白質作為激活劑或支架幫助procaspase定位、聚集及構象改變，常見于復雜多步的細胞凋亡信號傳導路徑中。

Caspase介導的細胞凋亡途徑

細胞凋亡途徑
Caspase介導的細胞凋亡途徑是細胞程序性死亡的一種重要機制，主要分為兩大類：外源性（死亡受體）途徑和內源性（線粒體）途徑。這些途徑通過激活一系列caspase蛋白酶來執行細胞凋亡過程。

1、外源性（死亡受體）途徑
啟動：當特定的配體如Fas配體或腫瘤壞死因子(TNF)結合到細胞表面的相應受體上時，該途徑被激活。這些受體屬于TNF受體家族成員。

信號傳導：配體與受體結合后，會募集接頭蛋白，并在細胞膜附近形成一個稱為死亡誘導信號復合物(DISC)的大分子復合物。這一過程導致起始caspase-8的自我剪切和激活。

執行階段：活化的caspase-8可以直接切割并激活效應caspases如caspase-3、-6、-7，直接觸發凋亡程序；或者通過裂解促凋亡蛋白Bid間接激活線粒體途徑，進一步放大凋亡信號。

2、內源性（線粒體）途徑
觸發因素：多種細胞內部刺激，包括但不限于DNA損傷、氧化應激、缺氧、細胞周期阻滯等，都可能激活這一途徑。

Bcl-2家族調控：在此過程中，Bcl-2家族中的蛋白質扮演關鍵角色。抗凋亡成員（如Bcl-2、Bcl-xL）抑制細胞凋亡，而促凋亡成員（如Bax、Bak）促進細胞凋亡。當促凋亡信號占優勢時，Bax/Bak會在細胞膜上形成孔道，導致線粒體膜通透性增加。

細胞色素c釋放：隨著線粒體膜通透性的增加，細胞色素c從線粒體內釋放到細胞質中，與其他蛋白一起組成凋亡小體(apoptosome)，激活caspase-9。

執行階段：激活后的caspase-9隨后激活下游的效應caspases如caspase-3、-6、-7，它們對特定底物進行切割，導致細胞結構的變化，最終導致細胞凋亡的發生。

這兩個途徑雖然有不同的觸發機制，但最終都是通過激活一系列caspase來執行細胞凋亡。此外，值得注意的是，在某些情況下，這兩個途徑并不是完全獨立的，而是可以相互作用、交叉調節，以確保細胞凋亡過程能夠準確無誤地進行。例如，外源性途徑可以通過激活Bid蛋白間接影響內源性途徑。同樣，內源性途徑也可以影響外源性途徑的效率和效果。這種復雜的交互網絡確保了細胞凋亡作為一種精確調控的生命現象得以實現。

Caspase的檢測方法
Caspase的檢測方式有：流式 、WB 、IF 、IHC 、ELISA等，如：

abs132005  Rabbit anti-Cleaved-caspase3 Polyclonal Antibody

利用裂解半胱天冬酶3(Asp175) ，p17Ab對不同樣品的提取物進行蛋白質印跡分析。泳道1： 大鼠肝臟，抗原特異性肽封閉。第二道：老鼠肝臟。第三道：大鼠脾臟

abs132005  Rabbit anti-Cleaved-caspase3 Polyclonal Antibody

IF/ICC法染色Hela細胞，樣品用PFA固定，在0.1%Triton X-100中透化，然后在25°C下在10%血清中封閉45min。然后將樣品與初級抗體(1:200)和小鼠抗β微管蛋白抗體(1:200)在37°C溫育1h。使用 AlexaFluor594綴合的山羊抗兔IgG(H+L)Ab(Red)和AlexaFluor488綴合的山羊抗小鼠IgG(H+L)Ab(Green)作為次級抗體。核反染色是DAPI（藍色）。

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