雙特異性抗體（BsAb）的結(jié)構和結(jié)合活性傳統(tǒng)表征方法優(yōu)缺點
BsAb簡介
1960年，美國Nisonoff課題組首次提出雙特異性抗體（BsAb）的概念。作為一種通過細胞融合、重組DNA或蛋白質(zhì)工程技術構建的人工抗體，BsAb能同時結(jié)合兩種不同抗原，展現(xiàn)出比單克隆抗體（mAb）或聯(lián)合療法更卓越的治療潛力。
目前，全球已有22款BsAb藥物獲批上市，主要集中在腫瘤領域。2024年全球BsAb市場規(guī)模約130億美元，預計到2032年將爆發(fā)式增長至2246億美元。僅2025年上半年，中國BsAb License-out交易總額就高達92.57億美元，CD3靶向的TCE雙抗、PD-1/VEGF雙抗等成為熱門布局方向。
表1. 中國近年BsAb交易事件（部分）
在結(jié)構上，BsAb可分為IgG樣和片段型兩大類；其作用機制多樣，包括細胞橋接、受體橋聯(lián)、介導復合物形成及“歸巢”型，極大拓展了治療應用的邊界。
圖1. 雙特性抗體結(jié)構示例（doi: 10.3390/ijms22105350.）
圖2. BsAb作用機制示意圖（doi: 10.3390/ijms22105350.）
BsAb結(jié)合活性表征方法
雙抗結(jié)合活性的檢測絕非兩個單抗檢測的簡單疊加。它是一個需要精心設計、相互驗證的系統(tǒng)工程，旨在確保雙抗分子不僅能結(jié)合兩個靶點，而且是以正確的結(jié)構、恰當?shù)谋壤推谕姆绞酵瑫r結(jié)合，從而驅(qū)動其預期的生物學功能。因此，無論是在檢測方法的開發(fā)、驗證還是在整個質(zhì)控流程中，其復雜性和挑戰(zhàn)性都遠高于單抗。傳統(tǒng)表征方法，如酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）和表面等離子共振（SPR），雖技術成熟，但在BsAb的應用中存在明顯瓶頸：固相界面效應、難以模擬協(xié)同結(jié)合、操作繁瑣、通量有限。
表2. 雙特異性抗體結(jié)合活性傳統(tǒng)表征方法
瑞孚迪（Revvity）的Alpha與HTRF均相檢測技術為BsAb的高通量篩選與質(zhì)控提供了高效解決方案，憑借其卓越的信噪比、操作簡便性、高重復性及更貼近生理狀態(tài)的溶液相反應環(huán)境輕松克服傳統(tǒng)方法的局限性，尤其適用于弱親和力相互作用的檢測，顯著加速BsAb的開發(fā)與穩(wěn)定性評價進程。
Alpha/HTRF技術原理
Alpha技術是基于供體微珠和受體微珠間的近距離放大的化學發(fā)光反應，HTRF技術是基于銪或鋱的穴狀化合物（供體）與XL665或d2（受體）之間的時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移，兩者均基于均相檢測技術原理，即所有組分在溶液中自由反應并直接讀數(shù)，無需洗滌步驟。
圖3. Alpha/HTRF原理示意圖
Alpha/HTRF檢測模型
不同結(jié)構類型的BsAb都可以使用HTRF/Alpha技術來表征結(jié)合活性，以IgG樣BsAb為例，其結(jié)合活性可通過帶有不同標簽的抗原（如生物素化抗原與His標簽化抗原）及相應標簽抗體的toolbox試劑進行評價。
表2. Alpha/HTRF檢測模型示意圖和實驗流程
Alpha/HTRF技術優(yōu)勢
- 高度模擬天然狀態(tài)：
均相反應，避免固相化帶來的構象改變問題，能更真實地反映結(jié)合活性。 - 適用于協(xié)同結(jié)合檢測：
其信號產(chǎn)生機制要求雙抗同時結(jié)合兩個靶點，可直接、高效地定量評估BsAb的雙特異性功能活性，而非簡單的單價結(jié)合。 - 卓越的弱結(jié)合檢測能力：
其均相體系與高信噪比特性，能有效捕捉低親和力的微弱結(jié)合事件，精準解析BsAb與靶點間的弱相互作用（低至pmol-μmol級）。 - 高通量與高效率：
免洗操作步驟大幅簡化流程和減少誤差，檢測流程約2-3 h，易于實現(xiàn)自動化，適合大規(guī)模篩選和常規(guī)放行測試。 - 高靈敏度與低樣本消耗：
優(yōu)異的信噪比，僅使用極少的樣本量（約2~5 μl）便可輕松檢測BsAb的結(jié)合。 - 操作便捷：
整個操作過程僅需添加試劑、孵育讀數(shù)即可定量或檢測BsAb結(jié)合活性。
案例分享
1.使用Alpha/HTRF技術，BsAb結(jié)合活性既可通過設置不同的結(jié)合實驗獲得BsAb結(jié)合活性的EC50值（三元復合物-夾心法，圖4,5），或BsAb篩選的IC50值（競爭法，圖6），其靈活的檢測模型滿足了客戶對BsAb結(jié)合活性驗證的個性化要求。
圖4. 抗mTIGIT/mPD-L1和抗mCD200/mCD47 BsAb檢測模型
圖5. 抗mTIGIT/mPD-L1和抗mCD200/mCD47 BsAb的結(jié)合量效
圖6. 使用未標記目標蛋白的競爭法結(jié)果
2.瑞孚迪基于AlphaPlex™技術，使用不同熒光微球（Eu/Tb），通過捕獲不同的發(fā)射波長區(qū)分Eu/Tb微球信號，可在同一反應中同時檢測BsAb與兩個不同靶點的結(jié)合。AstraZeneca開發(fā)的BsAb AlphaPlex方法在50~150%線性范圍內(nèi)表現(xiàn)出99%~107%的準確率，并檢測到光應激和熱應激條件下>50%的結(jié)合降解。此方法適用于BsAb的先導分子篩選、PK/PD分析、臨床相容性、商業(yè)批次放行和穩(wěn)定性測試等。
圖7. AstraZeneca的BsAb binding檢測模型、穩(wěn)定性研究和方法學驗證（doi: 10.1016/j.jim.2021.113099.）
3.瑞孚迪基于AlphaLISA™技術，BsAb在37℃下孵育12天后，檢測到BsAb的結(jié)合活性受到了影響；基于AlphaPlex™技術，進一步揭示了BsAb在37℃下，BsAb與PD-L1的結(jié)合是穩(wěn)定的，但與TIGIT的結(jié)合能力則受到了影響。AlphaPlex™特別適用于分析某個靶點的結(jié)合能力是否受損。
圖8. BsAb強制降解研究
4.在某些雙特異性抗體中，可能存在與抗原結(jié)合親和力較低的情況。例如，為降低毒性效應，部分T細胞銜接器（TCE）類藥物會通過工程化改造降低其與CD3的結(jié)合強度。若采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）進行檢測，洗滌步驟易導致此類低親和力結(jié)合復合物的解離，從而無法有效捕獲信號或CV值較大。而瑞孚迪的Alpha/HTRF平臺作為一種均相檢測技術，無需洗滌步驟，可在溶液相中直接檢測低至微摩爾（μM）級別的弱分子互作，顯著提高對低親和力結(jié)合事件的檢測靈敏度。
圖9. 低親和力分子互作案例（doi: 10.1021/acschembio.6b00286.）
