體外與體內(nèi)不同篩選環(huán)境下制備的CAR-T差異

文章來源公眾號：大魚科學(xué)            作者：大魚科學(xué)

2025年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)花落調(diào)節(jié)性T細(xì)胞領(lǐng)域的開拓性研究。然而，如何充分駕馭T細(xì)胞的治療潛力，仍面臨諸多挑戰(zhàn)。拋開“體內(nèi)與體外制備CAR-T”的路徑之爭，如何設(shè)計(jì)出功能更強(qiáng)、持久性更好的CAR-T細(xì)胞，是兩條技術(shù)路線共同面臨的核心挑戰(zhàn)。

遵循“優(yōu)勝劣汰”的基本邏輯，通過在細(xì)胞中人為引入突變，再施以定向壓力篩選出優(yōu)勢細(xì)胞，是借鑒“自然選擇”進(jìn)行定向篩選CAR-T的有效策略。追尋這一思路，在“體外制備CAR-T”中進(jìn)行的“體外篩選”，已經(jīng)產(chǎn)出了不少的成果。然而，最近的研究提示，僅僅將篩選環(huán)境由“體外”更換為“體內(nèi)”，便會(huì)得出一些不同的結(jié)論了。

01 篩選：選擇和演化
以往篩選產(chǎn)生的成果部分列舉如下（表1）。然而，目前絕大多數(shù)發(fā)現(xiàn)均基于體外篩選平臺獲得，然后再轉(zhuǎn)移至體內(nèi)進(jìn)行功能驗(yàn)證。這帶來一個(gè)根本性問題：體外培養(yǎng)與殺傷體系中所施加的選擇壓力（如激活、擴(kuò)增與存活條件）與體內(nèi)生理環(huán)境存在差異，導(dǎo)致以“體外適應(yīng)”為導(dǎo)向的篩選可能遺漏在“體內(nèi)環(huán)境”中更具優(yōu)勢的細(xì)胞類型。

表1. 篩選得到的能夠調(diào)控CAR-T適應(yīng)性的基因列表舉例

02 偏離：體內(nèi)vs體外
一項(xiàng)最新研究揭示了這一差異的冰山一角。該研究以135個(gè)基因?yàn)楹Y選起點(diǎn)，構(gòu)建了一個(gè)具有多樣性基因缺失的CAR-T細(xì)胞混合群體，并將其回輸至小鼠體內(nèi)（圖1）。研究團(tuán)隊(duì)在四個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行采樣：未經(jīng)篩選的初始T細(xì)胞群體（-11天）、CAR-T生產(chǎn)結(jié)束時(shí)（0天）、體內(nèi)作用早期（7天）及晚期（21天）。通過比較不同時(shí)間點(diǎn)特定基因缺失細(xì)胞類群的富集程度，可系統(tǒng)評估哪些基因的缺失有助于增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的功能與持久性。

圖1. 體內(nèi)篩選策略及采樣時(shí)間點(diǎn)示意圖。 實(shí)驗(yàn)中通過同步敲除TCR分子，實(shí)現(xiàn)對基因編輯后T細(xì)胞（CD3陰性群體）的特異性富集與追蹤。

體內(nèi)、外結(jié)果的偏離出現(xiàn)了：在體外制備階段表現(xiàn)出明確優(yōu)勢的RASA2基因（具體表現(xiàn)為其在采樣點(diǎn)2出現(xiàn)顯著富集），在回輸體內(nèi)后并未保持這一趨勢（圖2）；相比之下，CDKN1B在體內(nèi)環(huán)境中被穩(wěn)定選擇出來，具體體現(xiàn)為其在采樣點(diǎn)3至采樣點(diǎn)4期間呈現(xiàn)持續(xù)富集（圖2）

圖2. 特定基因敲除在CAR-T細(xì)胞體內(nèi)持久性中的動(dòng)態(tài)變化。 結(jié)果顯示RASA2缺失在體外制備階段（采樣點(diǎn)2）顯著富集，但在體內(nèi)環(huán)境中未持續(xù)優(yōu)勢；CDKN1B缺失則在體內(nèi)階段（采樣點(diǎn)3–4）表現(xiàn)出明顯富集。

從治療腫瘤的效果上看，RASA2缺失后在體外表現(xiàn)良好，但在體內(nèi)并沒有顯著的改善；而CDKN1B則恰恰相反（圖3）。

圖3. 體內(nèi)與體外篩選環(huán)境下出的基因缺失CAR-T在體內(nèi)外腫瘤殺傷效果中的比較。

03 體內(nèi)CART：篩選設(shè)計(jì)再思考
基于上述類似篩選策略探索增強(qiáng)CAR-T功能的基因，目前已積累多項(xiàng)研究成果。除表1所列基因外，一篇同期發(fā)表的研究亦提示了RHOG與FAS對CAR-T細(xì)胞的調(diào)控作用。這提示篩選策略的細(xì)微差別可能導(dǎo)致關(guān)鍵結(jié)論的不同；而篩選環(huán)境（體內(nèi)與體外）的選擇可能是導(dǎo)致結(jié)果差異的重要來源。值得注意的是，盡管當(dāng)前大多數(shù)篩選實(shí)驗(yàn)仍建立在“體外制備CAR-T”的技術(shù)框架內(nèi)，不同篩選環(huán)境導(dǎo)致的表型差異已顯而易見。

體內(nèi)制備的CAR-T在T細(xì)胞激活、擴(kuò)增與殺傷機(jī)制等關(guān)鍵生物學(xué)行為方面，與體外制備的CAR-T存在明顯差異。在此背景下，基于傳統(tǒng)“體外制備CAR-T模型”所建立的CAR分子設(shè)計(jì)原則、篩選體系以及基因編輯調(diào)控策略，是否仍然適用于體內(nèi)制備的CAR-T，目前尚無明確結(jié)論，提示了技術(shù)路徑分歧背后深層次的關(guān)鍵科學(xué)問題。結(jié)合人工智能在設(shè)計(jì)生命（病毒）方面的進(jìn)展，或許終有一天，人為定制設(shè)計(jì)CAR-T細(xì)胞也將成為現(xiàn)實(shí)。​