dTAG蛋白降解分析：針對靶蛋白的選擇性降解

引言

靶向蛋白質降解是一種新策略，旨在出于治療目的，從細胞中選擇性地消除特定蛋白質。雖然最初這項研究主要關注 PROTAC 分子，但如今，新的靶向降解方法正在涌現。其中之一就是降解 TAG （dTAG） 技術。

dTAG是一種創新的靶標驗證方法。像PROTACs一樣，該方法使用一種異雙功能小分子，建立目標蛋白與E3泛素連接酶之間的三元復合物。然而，dTAG技術的獨特之處在于，通過CRISPR/Cas9將雙功能降解劑的一部分結合位點人工引入到目標蛋白中，這使得dTAG成為進行靶標驗證研究、探討劑量依賴效應的理想工具。

本文所述的dTAG蛋白降解分析使用了雙熒光素酶報告系統來測量靶蛋白降解。為此，使用螢火蟲熒光素酶作為基準標記物，該標記物不應受到dTAG降解的影響。第二種熒光素酶是納米熒光素酶（Nanoluciferase），以碎片化的非活性形式（HiBiT）與靶蛋白融合。dTAG降解劑能夠通過引入的dTAG結合基序，將靶蛋白與E3泛素連接酶結合，從而形成三元復合物（見圖1）。這會導致靶蛋白及其融合的HiBiT片段的泛素化并隨之降解。為了測量納米熒光素酶的熒光發射，在降解后加入LgBiT。這個小的納米熒光素酶片段可以完成未降解的HiBiT片段，進而形成活性納米熒光素酶，產生熒光信號。納米熒光素酶與螢火蟲熒光素酶的發射比值則成為dTAG降解劑效能的指示，比例越低，目標降解程度越高。

圖 1：dTAG 蛋白質降解測定原理

圖 2：dTAG 蛋白質降解測試：測試了三種 dTAG 降解劑誘導靶向 HiBiT 降解的能力。將濃度為 0.1 至 10,000 nM 的 dTAG 降解劑添加到穩定表達 HiBiT 融合蛋白的 HEK 細胞培養物中。4 小時后，依次測量了螢火蟲螢光素酶和納米螢光素酶的化學發光

 
所有測試的dTAG降解劑均以濃度依賴的方式引起了納米熒光素酶發射量的下降（即HiBiT降解）。然而，不同的dTAG分子在HiBiT降解的程度上有所不同。dTAG-13（綠色曲線）引起約50%的降解和納米熒光素酶發射量的減少，而dTAG-v1（藍色曲線）則表現為最強的降解劑，幾乎完全降解了HiBiT。

在第二個實驗中，進一步評估了dTAG-v1降解劑的數據穩定性（見圖3）。在此實驗中，評估了1到10 µM濃度范圍的dTAG-v1，并進行了32次重復實驗，結果與DMSO對照組進行了比較。

圖3：dTAG-v1的評估：1到10 µM的dTAG-v1應用于穩定表達HiBiT融合蛋白的HEK細胞，并進行了32次重復實驗。用DMSO處理的細胞作為空白對照組。計算dTAG-v1 HiBiT信號的信號與空白比值（S/B值）以及 Z prime ，以評估數據穩定性

 
如圖 3 所示，與 DMSO 對照相比，所有三種濃度的 dTAG-v1 均導致 HiBiT 融合蛋白降解。信號與空白比值顯示，納米熒光蛋白化學發光信號隨濃度降低而降低，而 Z 因子為 0.84 至 0.87，表明數據穩定性良好。

結論

使用 dTAG 蛋白質降解檢測，測試的 dTAG 分子可成功用于誘導 HiBiT 融合蛋白質復合物的靶向降解。由于其高靈敏度、快速讀取時間和縮小規模的兼容性，PHERAstar FSX 非常適合此應用，與 iSTAR 板一起使用，性能與類似的酶標儀相當。

圖 4：PHERAstar FSX 酶標儀

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