PCR進階：GC-Rich片段的擴增策略詳解

前言

PCR擴增不出來條帶的原因有很多，諸如引物設計有誤，DNA模板已降解，酶失活或者有雜酶污染，緩沖液條件不當，模板DNA的GC含量太高等等。大部分原因可以通過換試劑得到解決，但是對于高GC含量的樣本，擴增起來始終是有難度。

模板GC含量高就難以擴增的原因在于G、C之間形成三對氫鍵，解鏈所需能量較高，故模板較難打開，在常規(guī)變性溫度下，DNA模板變性不完全，同時由于單鏈的G＋C豐富區(qū)易于自身互補配對形成穩(wěn)定的發(fā)夾環(huán)二級結構，而使PCR引物難以結合到模板上。

目前，研究學者建立了各種不同的方法來解決高GC含量DNA模板擴增困難的問題。常用的方法包括：

1、添加增強劑，如甘油、DMSO等，有助于打開復雜二級結構；

2、提高變性溫度，比如96度5分鐘然后再加熱啟動酶；

3、降落PCR，在PCR循環(huán)過程中逐步降低退火溫度，從而在初始階段提高退火溫度, 減少非特異性結合，提高特異性擴增；

4、提高PCR擴增儀的瞬時功率，利用更大的能量打開DNA的二級結構，從而提高PCR反應的效率‌。

PCR技術不斷發(fā)展, 高功率PCR擴增儀已作為一項新型技術，逐漸被應用于解決GC含量高的DNA模板擴增難題。這種儀器通過提供更強的熱循環(huán)能力，能夠有效地打開DNA的二級結構，特別適合于高GC含量的樣本擴增。

艾普拜生物重磅推出精衛(wèi)自動PCR儀, 瞬時功率可達750W, 不僅提高了復雜樣本擴增實驗的成功率，還大大縮短了實驗時間，為研究人員提供了強而有力的科研工具。

精衛(wèi)自動PCR儀的優(yōu)勢：

1、更高效的熱循環(huán): 高功率可以減少達到變性溫度所需的時間，使模板能夠充分變性，為后續(xù)的引物結合和延伸步驟創(chuàng)造良好條件。

2、均勻的熱傳遞: 高功率 PCR 儀能夠提供更均勻的加熱，避免部分模板無法完全變性或引物結合不充分導致擴增不成功，提高反應的穩(wěn)定性和重復性。

3、適應高難度的PCR反應: 在一些特殊的 PCR 應用中，如長片段DNA 、高 GC 含量的樣本擴增、復雜二級結構等。

4、減少溫度波動: 對于高 GC 含量的模板，溫度的微小波動可能會影響 DNA 雙鏈的穩(wěn)定性和引物的結合效率，高功率 PCR 儀可以更好地維持溫度的穩(wěn)定性，保證高 GC 片段的順利擴增。

應用案例：

儀器：Kingwell 96，高GC含量，反應體系：10ul