瓊脂糖凝膠電泳方法和步驟介紹

瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)安裝電泳管

選擇聚含均勻、無(wú)氣泡、無(wú)裂縫、膠面平整并與管壁沒(méi)有脫離現(xiàn)象的合格凝膠電泳管 插入上電極槽底板的各圓孔中，留1/5在底板上方，保證使電泳管與底板垂直，密封處不 致滲漏。

(2) 加樣

可利用上述方法制成樣品膠，也可以用如下的一種方法加樣。將樣品溶于200mg/ml濃度的蔗糖溶液中，或溶在10%甘油中，然后加在濃縮膠的 表面�；�?qū)⑷刍�的瓊脂與樣品溶液混合后加在濃縮膠表面�；蛴门c電泳管內(nèi)徑相近的圓形厚濾紙片，將樣品溶液吸收后，緊貼在濃縮膠表面。 如樣品是固體，應(yīng)先溶在濃縮膠緩沖液中，并加入足夠量lmol/L的蔗糖溶液，使樣 品溶液的比重增大，再加在濃縮膠表面.必須保證樣品溶液具有低電導(dǎo)性，鹽濃度不應(yīng)超過(guò)0. 05mol/L。

目前常用的加樣方法是：用稀釋5-10倍的濃縮膠緩沖液，使其成lmg/ml的濃 度，再加蔗糖使成濃度，然后在濃縮膠面上有電極緩沖液存在的情況下，用合 適的加樣工具如微堇注射器，插入濃縮膠面與上方的電極緩沖液界面處，輕輕地將樣品加 在濃縮膠面上.

(3) 加電泳緩沖液

樣品加入后，在上下兩個(gè)電泳槽中灌注電極緩沖液，緩沖液的溫度需與電泳溫度一 致。加入緩沖液時(shí)應(yīng)小心操作，不能攪動(dòng)電泳管中的樣品溶液，并不使電泳管上下口留有 氣泡。緩沖液的用垃隨容器的大小而有異。一般情況下電極槽中的緩沖液量能使電泳管 至少有3/5浸入緩沖液為宜。

(4) 加指示染料

對(duì)于電泳系統(tǒng)常用的指示染料為0. 001%溴酚藍(lán)，酸性系統(tǒng)常用的是0. 005%甲基綠 或甲烯藍(lán)。用量為每500ml緩沖液加指示染料1mlD 一般加在上電泳槽緩沖液中。

(5) 瓊脂糖凝膠電泳

在電泳槽上裝配好電極，接通直流電源。堿性系統(tǒng)上電極接負(fù)極，酸性系統(tǒng)上電極接正極。對(duì)于直徑5〜7mm的凝膠，初2分鐘用1mA/管的電流進(jìn)行電泳，然后逐漸升高到 2〜5mA/管（10分鐘）。通常5mm X 65mm的凝膠在20 C時(shí)用4mA/管進(jìn)行電泳,大約需時(shí)40分鐘。在電泳過(guò)程中，常要求電流保持恒定。此時(shí)，電壓會(huì)有升高。如果電流大而產(chǎn)生過(guò)高 的歐姆熱，影響某些樣品時(shí)，可以降低電流而延長(zhǎng)電泳時(shí)間。

電泳時(shí)間的長(zhǎng)短與所用電流和凝膠的長(zhǎng)度有關(guān)。為了節(jié)約時(shí)間也可以使用天能預(yù)制膠。但即使應(yīng)用同樣長(zhǎng)度的凝膠，也會(huì)因凝膠系統(tǒng)和 樣品性質(zhì)的不同，而使電泳時(shí)間有差別。對(duì)于一般的 分析工作來(lái)說(shuō)，如指示染料已遷移至距凝膠下端3〜 6mm時(shí),就可停止電泳，切斷電源,取出電泳管。電極緩沖液可重復(fù)使用若干次，上下電極緩沖 液一般不要混合貯存，也不要將前一次的負(fù)極緩沖 液作下一次電泳時(shí)的正極緩沖液。因?yàn)榻?jīng)電泳后，二 電極的緩沖液組成已有了變化。

有時(shí)候，我們需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的電泳。例如:DNA的分離有時(shí)長(zhǎng)達(dá)10余小時(shí)。為了防 止由于電極反應(yīng)使緩沖能力耗盡從而引起pH的變化影響分離，1977年美國(guó)匹茲堡大學(xué) T.G. Cooper提出用循環(huán)緩沖液的辦法來(lái)保持緩沖能力不致耗盡，以達(dá)到緩沖溶液能較 長(zhǎng)期使用的目的。

上下兩個(gè)電泳槽的緩沖溶液水平保持恒定，但又沒(méi)有建立通路。下槽的緩沖液可靠輸 液器一滴一滴地滴入上槽。而當(dāng)上槽的緩沖液增加時(shí)，就會(huì)經(jīng)溢流管滴回到下槽，使上下 兩槽的緩沖液水平在電泳過(guò)程中始終保持恒定。要注意的是,滴入上槽中的緩沖液，必須 不是線狀連續(xù)的。 

瓊脂糖凝膠的取出

電泳結(jié)束取出電泳管。然后,用配有細(xì)長(zhǎng)針頭并盛有水的注射器，將針頭小心地插入 凝膠和玻璃管壁之間，邊插入轉(zhuǎn)動(dòng)管子同時(shí)壓進(jìn)一些水，另一端也作同樣處理。然后，將管F套上橡皮管用自來(lái)水壓力壓出凝膠，或用洗耳球壓岀凝膠。如果壓岀凝膠困難時(shí)，注射 器內(nèi)可裝甘油代替水壓入凝膠和管壁之間。也可以用一根金屬細(xì)絲，從凝膠和管壁之間穿 過(guò)整個(gè)玻璃管，然后，拉緊金屬細(xì)絲轉(zhuǎn)動(dòng)玻璃管一周，就能使凝膠脫離管壁，再用洗耳球擠 壓，就很容易壓出。

也可以將電泳管浸入甲醇中，使凝膠收縮與管壁脫離而取岀，或根據(jù)具體條件用別的 辦法取出凝膠。但必須注意，無(wú)論用何種辦法，必須不損傷膠面。特別是濃度低的大孔凝 膠，機(jī)械強(qiáng)度差，取岀時(shí)應(yīng)格外小心。