超濾裝置和濾板在分子克隆和 PCR 流程中的高通量應用

超濾裝置和濾板為分子克隆和 PCR 流程提供更高通量選擇

現如今，幾乎所有生物研究領域都會涉及分子克隆技術。所謂的克隆是指，在大多數細菌載體（如質粒）中插入基因序列，之后，研究人員便可大量復制所插入的序列。完成克隆之后，即可對這些序列進行操縱和表達，從而為開展功能性研究提供支持。

傳統的 DNA 片段克隆方法涉及將從染色體、質粒或粘粒獲得的限制性內切酶消化片段連接到所選克隆載體的特定位點。標準分子克隆技術需要通過酶促修飾和純化步驟來制備用于連接和轉化到細菌細胞中的 DNA 序列。通常情況下，要轉移用于克隆的 DNA 序列，首先需要使用限制性內切酶消化 DNA 以產生末端序列突出端（也稱為粘性末端），這有助于連接到經過相似處理且具有兼容粘性末端的載體中。在每個消化步驟后，需要去除釋放的接頭序列，以免其在隨后的片段連接期間與所需的插入片段競爭，從而顯著增加假重組體的數量。將接頭從所需產物中分離出來的最常用的純化方法是，先進行 DNA 電泳，然后從凝膠中回收所需的 DNA 片段。

雖然限制性內切酶消化在克隆過程中仍然很重要，但其使用方法已然發生了改變。相比于單純依靠限制性內切酶消化來獲取用于克隆的序列，目前主要采用聚合酶鏈式反應 (PCR) 來生成和制備用于克隆的序列RNA 逆轉錄產生的 DNA 或 cDNA 可作為 PCR 擴增的模板。PCR 的一個主要優勢在于，它提供了一種更為直接的方法，可將限制性位點整合到擴增引物中，從而引入定向克隆擴增序列所需的限制性位點。

標準技術通常涉及多個純化步驟，每個步驟都會導致大量的產物損失，因此需要大量的起始 DNA 才能保證有足夠的載體和插入材料來完成后續的連接和轉化步驟。1由于需要生成重組 DNA 分子的應用數量龐大，因此需要一種能夠將 PCR 產物或其他來源中的 DNA 片段轉化為所需載體的快速方法。

如果樣本量較少，則可以使用 Pall Nanosep^® 等離心超濾裝置來執行此類步驟。而對于通量需求更高的應用，可以使用帶有相同超濾膜的 Pall AcroPrep^™ Advance 96 孔過濾板。隨著研究人員需要制作的樣本或構建體越來越多，如果能在高通量工作流程中使用過濾板，這無疑十分具有吸引力。

在本科學簡報中，我們將介紹如何在各個克隆工作流程步驟中應用這些超濾裝置來提供更加簡化的工藝，并將這些步驟與傳統的 PCR 生成片段的亞克隆方法進行比較。在優化有效靶 DNA 純化的參數后，我們合成了帶有含限制性位點的末端接頭序列的 PCR 產物。這些接頭經過消化后，產生了適合連接的粘性末端。之后，將得到的 DNA 產物進行濃縮和脫鹽，同時通過離心步驟使引物和接頭片段流入廢棄的濾液（圖 1）。得到的 DNA 片段直接在超濾裝置內完成與消化載體的連接反應，然后轉化為感受態細胞。使用超濾裝置，尤其是 Acroprep Advance 96 孔過濾板，能夠大大節省時間、人工和起始材料，且轉化重組體的數量與傳統技術獲得的數量大致相當。

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