基因型鑒定試劑盒使用說明書
試劑盒成分
1、 YSY Buffer
2、2*PCR Master Mix（使用實驗室常用的酶即可，由客戶自備）
儲藏條件：4oC
實驗步驟
1、細胞與動物組織的準備：
1.1 培養細胞準備：
以培養密度為 1´106 個/ml 為例，在超凈臺內取 1ml（內含 300-1000 個細胞）；對于某些類貼壁細
胞，可直接刮取側壁細胞，植入已編號的 PCR 管內。
取適當部位，采集血液 1 ml。
注意：如果樣品在 10 分鐘內處理，則無需抗凝處理；在高通量采樣情況下，如果樣品在塑料PCR管內需存放 10 分鐘以上，需采用抗凝處理。
1.3 哺乳動物組織準備：
采集相應部位，剪取 1mm3（1 ml）左右組織放入已編號的 PCR 管內。
1.4 斑馬魚尾鰭、果蠅等其他模式動物組織準備：
選取尾鰭、翅膀等無損害部位，可通過剪取、穿孔或針刺等方法制備少量新鮮組織，體積約 1mm3
即 1 ml。
2、基因組 DNA 模板的制備
1、 YSY Buffer
2、2*PCR Master Mix（使用實驗室常用的酶即可，由客戶自備）
儲藏條件：4oC
實驗步驟
1、細胞與動物組織的準備：
1.1 培養細胞準備：
以培養密度為 1´106 個/ml 為例，在超凈臺內取 1ml（內含 300-1000 個細胞）；對于某些類貼壁細
胞，可直接刮取側壁細胞，植入已編號的 PCR 管內。
- 血液準備：
取適當部位，采集血液 1 ml。
注意：如果樣品在 10 分鐘內處理，則無需抗凝處理；在高通量采樣情況下，如果樣品在塑料PCR管內需存放 10 分鐘以上，需采用抗凝處理。
1.3 哺乳動物組織準備：
采集相應部位，剪取 1mm3（1 ml）左右組織放入已編號的 PCR 管內。
1.4 斑馬魚尾鰭、果蠅等其他模式動物組織準備：
選取尾鰭、翅膀等無損害部位，可通過剪取、穿孔或針刺等方法制備少量新鮮組織，體積約 1mm3
即 1 ml。
2、基因組 DNA 模板的制備
- 加樣
- 10ml 的 YSYBuffer 液分別逐一加入裝有組織或細胞的 PCR 管壁（注意勿將槍頭碰到組織
YSY Biotech 基因的故事 讓斑馬魚來為您講述
樣品，防止污染）；加樣完畢后，將 PCR 管快速離心，確保溶液和組織或細胞均位于 PCR 管
底部；
- 制備基因組模板
- PCR 管放入 PCR 儀中，啟動 PCR 程序：65℃×30min、95℃×5min、16℃×1min。基因組
模板若不立即使用，請放入-20℃保存。
3、目標基因的 PCR 擴增（以下試劑請自備）
3.1 取用新的 PCR 管，按下列順序組裝 PCR 反應體系：
20 ml 反應體系（產物直接凝膠電泳進行基因型鑒定用）
基因組 DNA 模板（步驟 2.2 所得）：1 ml
2 × PCR Master Mix：10 ml（自備）
正向引物（5mM）： 1ml （自備）
反向引物（5mM）： 1ml （自備）
超純水： 7 ml（自備）
- 組裝完畢后，將 PCR 管快速離心，確保所有溶液均位于 PCR 管底部；
- 將 PCR 管放入 PCR 儀中，啟動客戶自行設計的 PCR 程序完成 PCR 擴增。
4、PCR 產物驗證
取 2ml 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳進行基因型鑒定；若需進一步測序，可將余下的產物直接送測
序；若需酶切鑒定，則在經 PCR 產物純化試劑盒純化后，用核酸酶內切酶進行酶切鑒定。
注：測序公司一般額外收取 5 元錢的切膠費用，請在送測前和測序公司確認無需切膠回收。
5、結果閱讀（基因突變及突變率分析）
如果基因型可由引物特異性識別，則通過將觀測 PCR 產物電泳結果確定基因型；通過測序確定基
因型的，其測序結果可通過人工閱讀測序的色譜圖，識別突變等位基因的基因型，確定突變率。核
酸內切酶酶切結果可通過對凝膠電泳條帶的灰度分析，確定突變率。
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