化合物結構鑒定：UHPLC 聯用Q Exactive Focus分析霉酚酸酯的降解產物
引言
強制降解實驗能揭示各種環境因素對原料藥和制劑的影響。它能提供藥品安全信息、確定推薦儲存條件、保質期和分析方法的特異性。而降解產物的信息能幫助改進化合物或配方的發展。霉酚酸酯（MMF）的商標名稱為驍悉（CellCept），是一種免疫抑制劑和霉酚酸（MPA）的前體藥物。MMF 廣泛的應用在治療器官移植排異反應和自體免疫疾病的移植藥物中，為本研究選擇的模型化合物。
本文采用高分辨臺式質譜儀 Q Exactive Focus 開發了一種快速可靠的分析霉酚酸酯降解產物的完整工作流程，采用HRAM全掃描和數據依賴 MS/MS 在高分辨率和極性切換模式下實現降解產物的快速鑒定。HRAM MS 和 MS/MS 譜圖以及正/負離子模式切換，能可靠完成降解產物的定性和結構鑒定。
實驗方法
液相色譜方法
UHPLC：Thermo Scientific Ultimate 3000 RSLC
色譜柱：Thermo Dionex Acclaim 2.1×150 柱 , 2.2 µm
柱溫：35 ℃，流速：0.5 mL/min，進樣體積：1 µL
流動相：A -0.1% 甲酸水溶液
B - 含 0.1% 甲酸的乙腈
梯度洗脫：
0-0.5 min 保持 20% B，然后在 15 min 內線性增加到 40%B
質譜方法
質譜儀：Thermo Scientific Q Exactive Focus 臺式高分辨質譜儀
HESI-II 離子源： ESI 正 / 負離子切換
全掃描采集：m/z 120-1000 amu，分辨率為 70,000（FWHM@m/z 200）
MS/MS 采集：17,500 分辨率下數據依賴采集，HCD 歸一化
碰撞能：35%，25% 階梯變化
樣品前處理方法
• 霉酚酸酯儲備液，濃度為 2.5 mg/mL 的乙腈溶液，稱取25mg標準品配制在10 mL乙腈中。
• 鹽酸（0.01 N，pH 2），乙酸銨（5 mM，pH 6），氫氧化鈉（0.01N，pH 8）和過氧化氫（3%，pH 8.2）。購買的 30% 過氧化氫用水稀釋 10 倍后用于酸、堿和氧化研究。用氫氧化銨或乙酸調節強制降解溶液 pH 值。
• 用如上 pH 2、pH 6、pH 8 的溶液和過氧化氫（3%，pH 8.2）將濃度為 2.5 mg/mL 的霉酚酸酯儲備液稀釋 10 倍配制濃度為0.25 mg/mL 的強制降解溶液。強制降解溶液放置于60℃烘箱中。在放置的第 1、20、48 和 72 小時分別取樣，直接進樣到 LC/MS 中進行分析。
實驗與討論
圖 1.MMF在pH 2.0和60℃條件下反應1、20、48和72小時的總離子流色譜圖
1.UHPLC- 高分辨率 MS 快速測定降解產物采用 UHPLC- 高分辨率 MS 快速分析降解產物。高質量的HRMS 全掃描圖譜為測定降解產物的元素組成提供了重要信息，并從隨后的數據依賴 MS/MS 獲得分子離子的裂解信息。
具備階梯式碰撞能量的高分辨高能碰撞解離功能產生了信息量豐富的碎片，能更輕松地完成降解產物的結構鑒定。
快速正 / 負離子切換實驗采用在正離子模式下完成一次全掃描，然后進行數據依賴 MS2HCD 裂解。隨后轉換到負離子模式下進行全掃描和數據依賴 MS2HCD 裂解。自動極性切換提供了不同但是互為補充的降解產物的裂解信息。這些獨特極性的碎片能幫助確認結構鑒定結果（圖 5）。
本文研究了霉酚酸酯 API 在 pH 2.0、3.5、6.0 和 8.2 條件下的熱和過氧化氫降解。采用臺式高分辨率質譜儀 Q Exactive Focus 與 UHPLC 系統聯用快速準確地分析了降解產物。高分辨率準確質量數測定（HRAM）的全掃描圖譜可獲得降解產物元素組成的關鍵信息，實現了快速的鑒定。信息量豐富的高能量碰撞解離（HCD）MS/MS 圖譜有利于準確鑒定降解產物。全掃描和 MS/MS 模式下的正 / 負離子切換模式能全面鑒定降解產物。數據分析軟件 Mass Frontier 極大的提高了降解產物結構解析的速度和可靠性。Q Exactive Focus 臺式 Orbitrap MS 具有強大的功能，能快速高效地完成降解產物分析，從而顯著提高了藥物研發過程中降解產物的鑒定通量。
