免疫組化實驗防脫片的處理方法

脫片是免疫組織化學中經常遇到的問題(尤其是腦組織冰凍切片)，一般來說脫片主要有以下幾種原因：

   1. 組織固定、脫水、透明不充分

   2．組織切片過厚

   3．組織切片有折疊

   4．過度的熱抗原修復(高壓、微波、水煮)處理或抗原修復液的pH偏高

   5．操作過程中，沖洗方法不正確等

 在實際操作的過程中，除了要注意以上幾點之外，防脫片的應用是很有必要的，市售的防脫載玻片一般為正電荷玻片，不同品牌之間品質存在差異，而即使是較好的PREMIER玻片其防脫效果有時也不能令人滿意，而且假貨較多，因此，實驗室常常需要自己處理防脫載玻片，步驟如下：

1. 玻片的酸處理

 使用實驗室常用的次強酸清潔液（重鉻酸鉀120g，濃硫酸200ml，蒸餾水1000ml）浸泡玻片24小時，流水充分沖洗后在用蒸餾水沖洗三遍，置于95%乙醇中浸泡12小時，取出放烘箱中烤干或自然風干。

2. 黏附劑的使用

目前常用的黏附劑有三種：明膠-硫酸鉻鉀，APES（3—氨丙基—乙氧基甲硅烷），多聚左旋賴氨酸（poly-1—lysine）

（1）明膠-硫酸鉻鉀，這種方法十分簡便實用，不僅用于傳統染色，而且能夠用于免疫組化、原位雜交等檢測，目前實驗室大多數時候可以常規用該黏附劑。該方法的美中不足是在pH值高于8.0的堿性環境中（如使用PH9.0的TE抗原修復液）加溫到80度以上，切片還是容易脫落，因此選用此種黏附劑時宜采用PH6.0的檸檬酸鈉抗原修復液。

配制方法：將5g明膠溶解于1L熱的蒸餾水中，待冷卻后加入0.5g硫酸鉻鉀充分攪拌溶解，將玻片浸泡其中30分鐘，取出自然晾干后再次浸泡30分鐘，晾干裝盒備用。如果效不能滿足需要，可將濃度提高一倍，即10g明膠+1g硫酸鉻鉀/L。（更高的濃度本實驗室未做嘗試）

（2）APES（3—氨丙基—乙氧基甲硅烷）要用丙酮稀釋，而丙酮有導致肝硬化的作用，需注意人身防護。該方法彌補了部分高溫堿性溶液脫片的問題。另外，有說法認為已經貼好的片子如果有脫片現象，可用此法浸泡3分鐘，晾干后進行下一步，但經本實驗室驗證效果并不好。

配制方法：將APES用丙酮稀釋（APES:丙酮=1:50），洗凈的玻片浸入溶液中20秒，取出控去多余溶液，再浸入純丙酮或蒸餾水中洗去未結合的APES，晾干裝盒備用。（注意：此溶液需現用現配，因此盡量一次批量處理盡可能多的玻片以充分利用。）

（3）多聚左旋賴氨酸（poly-1—lysine），這種方法相當昂貴。但是，如果進行高壓堿性修復，可能總體上效果是最佳的。普通組化實驗和免疫組化酸性修復（大多數的情況）則沒有必要常規使用。多聚賴氨酸一般常見的分子量有70,000～150,000，150,000～300,000和>300,000，分子量越大，黏附力越強，但相對完全溶解較困難。

配制方法：按照0.1mg/ml的濃度用雙蒸水溶解多聚賴氨酸，將洗凈的玻片盡在溶液中5分鐘（增加時間不會提高粘附效果），自然晾干裝盒備用。如果要節約試劑，可使用直接涂布法，用移液器吸取溶液涂布于玻片上需要貼片的區域，可隨意控制面積大小，一般用量控制在20μl/cm2。（注意：1.浸泡法每100ml多聚賴氨酸溶液包被的片子一般不超過100張，包被過多會降低粘附力。2.多聚賴氨酸溶液4℃保存，一年內穩定。3.冰箱內取出的多聚賴氨酸溶液使用前要先恢復到室溫方可正常使用。）

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