Neutral Protease II在細胞分離、組織解離與類器官培養上的應用

胞外基質（ECM）作為細胞賴以生存的外界微環境，不僅為細胞提供結構支撐，還通過與細胞表面受體的相互作用調控細胞增殖、分化、遷移等關鍵生物學過程。在細胞生物學研究中，實現細胞與細胞外基質的溫和解離、組織器官中細胞的精準分離是開展實驗的前提。Neutral Protease II（中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）作為一種具有獨特底物特異性的中性金屬蛋白酶，能夠在保持細胞活性的前提下，選擇性降解細胞外基質中的纖維連接蛋白、層粘連蛋白等關鍵成分，同時避免對細胞表面的蛋白造成過度損傷。因此，Neutral Protease II在原代細胞的分離與培養、組織器官中的細胞解離以及類器官研究中有著廣泛的應用。AbMole為全球科研客戶提供高純度、高生物活性的抑制劑、細胞因子、人源單抗、天然產物、熒光染料、多肽、化合物庫、抗生素等科研試劑，全球大量文獻專利引用。

一、Neutral Protease II的作用機理
Neutral Protease II （中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）是一種源自芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）的M4 家族金屬蛋白酶，其成熟肽鏈由約480個氨基酸殘基組成，Neutral Protease II 的三維結構呈現典型的 “沙漏型” 折疊，核心區域包含一個由鋅離子、兩個組氨酸（His）和一個谷氨酸（Glu）組成的活性中心，即 “HEXXH” 保守序列，這一結構是金屬蛋白酶催化底物水解的關鍵位點。Neutral Protease II 具有嚴格的底物選擇性，主要作用于細胞外基質中的纖維連接蛋白、層粘連蛋白、膠原蛋白 IV 型等非纖維狀膠原成分，對 I 型、II 型等纖維狀膠原的降解活性較低。其底物識別位點通常為含有亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）等疏水氨基酸殘基的肽鍵，尤其偏好水解位于疏水性氨基酸 C 端的肽鍵，這種特異性使其能夠精準解離細胞與細胞外基質之間的連接，而對細胞間直接連接（如緊密連接、橋粒）的影響較小。Neutral Protease II 的最適 pH 值范圍為 7.0-8.0，屬于中性蛋白酶，在生理 pH 環境下可保持較高的催化活性，Neutral Protease II 的最適反應溫度為 37℃，與哺乳動物細胞的培養溫度一致，進一步提升了其在細胞相關實驗中的適用性。此外，Neutral Protease II 的活性依賴于鋅離子的存在，EDTA 等金屬離子螯合劑可通過螯合鋅離子顯著抑制Neutral Protease II 的活性，而 Ca²⁺則對該酶的穩定性具有一定的促進作用，在反應體系中添加適量 Ca²⁺可延長其活性維持時間。

二、Neutral Protease II在科研領域中的應用
1. Neutral Protease II（中性蛋白酶II，分散酶II）用于原代細胞分離
原代細胞因其保留了體內細胞的生物學特性，在細胞功能研究、藥物篩選模型的構建等領域具有不可替代的作用。然而，組織中的細胞被大量胞外基質包裹，傳統的機械研磨或胰蛋白酶消化方法往往存在細胞活性低、分離效率差等問題。Neutral Protease II（中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）憑借其溫和的解離特性，已成為多種組織原代細胞分離的首選工具酶之一。例如，在小鼠乳腺上皮細胞的分離中，將乳腺組織剪碎后用 Neutral Protease II在 37℃下孵育 1-2 小時，可有效降解乳腺組織中的細胞外基質，使上皮細胞團從間質組織中分離，后續再聯合Collagenase I 消化，即可獲得高活性的乳腺上皮單細胞懸液^{[1, 2]}。類似地，在神經干細胞的分離中，Neutral Protease II 可用于從胼胝骨下方區域分離出神經干細胞。相較于胰蛋白酶，Neutral Protease II 能更好地保留神經干細胞的自我更新能力和分化潛能，分離得到的細胞在體外培養體系中可形成更多的神經球，且向神經元和膠質細胞分化的比例更高^[3]。2014年，AbMole的兩款抑制劑分別被西班牙國家心血管研究中心和美國哥倫比亞大學用于動物體內實驗，相關科研成果發表于頂刊 Nature 和 Nature Medicine。

圖 1. 利用Neutral Protease II從胼胝骨下區分離出神經干細胞并形成神經球^[3]

2. Neutral Protease II用于貼壁細胞傳代
對于某些貼壁生長能力較強的細胞系（如成纖維細胞、上皮細胞），傳統的胰蛋白酶消化法可能導致細胞表面蛋白損傷，影響細胞的后續生長和功能。Neutral Protease II（中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）可通過特異性降解細胞與培養皿表面之間的細胞外基質成分（如纖維連接蛋白），實現細胞的溫和解離。在實際操作中，將 Neutral Protease II 溶液加入培養皿中，37℃孵育數分鐘后，細胞即可從培養皿表面脫落，且細胞聚集體較小，輕輕吹打即可分散，這可降低細胞機械損傷的風險。研究表明，使用 Neutral Protease II 傳代的人皮膚成纖維細胞，其細胞活力和生長狀態要優于傳統胰蛋白酶和EDTA消化的細胞，這表明Neutral Protease II 對某些細胞的生理功能影響更小^[4]。

3. Neutral Protease II用于組織器官解離
隨著單細胞測序技術的快速發展，獲取高質量的單細胞懸液成為該技術應用的關鍵前提。對于結構復雜的組織器官（如肝臟、腎臟、肺臟），Neutral Protease II （中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）常與其他酶，如膠原酶（Collagenase II，AbMole，M9973）、透明質酸酶（Hyaluronidase，AbMole，M9941）聯合使用，構建高效的組織解離方案。以肌肉和骨骼組織為例，Neutral Protease II可聯合Collagenase I（膠原酶 I ） 、Collagenase II（膠原酶II） 、Pronase 等酶從上述組織中分離出包括間充質干細胞、骨譜系細胞、軟骨細胞、成纖維細胞、內皮細胞在內的單細胞混合群，這為單細胞測序技術提供了基礎^[5]。

圖 2. 來自不同肌肉骨骼組織的單細胞分離方案示意圖^[5]

4. Neutral Protease II用于三維細胞培養與類器官構建
類器官培養技術能夠模擬體內細胞的生長微環境，更真實地反映細胞的生物學行為。在類器官（包括腫瘤類器官、胚胎干細胞或誘導多能干細胞衍生的類器官）培養中，細胞一般接種于基質膠等三維支架中。如何從基質膠有效回收類器官細胞且不影響細胞的生物學參數，是類器官培養中的關鍵問題。Neutral Protease II（中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）可用于類器官中的基質膠降解和類器官的消化傳代。

圖 3. Dispase與其它基質膠降方法的比較^[6]

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參考文獻及鳴謝
[1] John Stingl, Joanne T. Emerman, Connie J. Eaves, Enzymatic Dissociation and Culture of Normal Human Mammary Tissue to Detect Progenitor Activity, in: C.D. Helgason, C.L. Miller (Eds.), Basic Cell Culture Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, 2005, pp. 249-263.
[2] Rana Mroue, Mina J. Bissell, Three-Dimensional Cultures of Mouse Mammary Epithelial Cells, in: S.H. Randell, M.L. Fulcher (Eds.), Epithelial Cell Culture Protocols: Second Edition, Humana Press, Totowa, NJ, 2013, pp. 221-250.
[3] J. Y. Kim, J. H. Lee, W. Sun, Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone, Journal of visualized experiments : JoVE (118) (2016).
[4] J. J. Cassiman, M. Brugmans, H. Van den Berghe, Growth and surface properties of dispase dissociated human fibroblasts, Cell Biology International Reports 5(2) (1981) 125-132.
[5] Manman Gao, Peng Guo, Xizhe Liu, et al., Systematic study of single-cell isolation from musculoskeletal tissues for single-sell sequencing, BMC Molecular and Cell Biology 23(1) (2022) 32.
[6] M. Wang, H. Yu, T. Zhang, et al., In-Depth Comparison of Matrigel Dissolving Methods on Proteomic Profiling of Organoids, Molecular & cellular proteomics : MCP 21(1) (2022) 100181.