生物制造工藝中幾種常用的CHO細胞系介紹

細胞株在整個生物制造工藝中有著至關重要的地位，一株高產、穩定的細胞株不僅使得上游生產工藝變得簡單，同時還可能有利于降低下游生產工藝的復雜度及整個生產工藝的成本。因此，各大制藥公司均對細胞株的選用及穩定細胞株構建非常重視。最近兩年，隨著行業的逐步成熟，大家開始普遍重視對宿主細胞的選擇，除了要求有清晰的歷史背景信息外，在選擇時還要考慮研發周期、成本以及后期整體的生產成本。

CHO細胞最早由Puck實驗室在1957年分離，通過將0.1g中國倉鼠卵巢組織酶解消化獲得。
 
1958年Puke實驗室將此連續傳代細胞進行重新克隆后，建立了我們現在所用的CHO細胞最原始細胞系。這個最原始的CHO細胞系是脯氨酸缺陷型的，必須在培養基中添加額外的脯氨酸以支持其生長，目前所有已知的CHO細胞系均保留了這個特性。這個最原始的CHO細胞系后來流轉到不同的實驗室和公司，經過不同的培養、馴化、改造和重新克隆后形成了不同種類的CHO細胞系。這些細胞系雖然都是來源于最原始的CHO細胞系，但由于CHO細胞基因組內在的不穩定性及后續不同實驗室的篩選培養條件不同，不同CHO細胞系之間的形態、生長、表達、代謝、甚至基因組都有較大差異，下面就幾種常用的CHO細胞系進行描述。
 
1.CHO-K1

CHO-K1是未經改造的野生型CHO細胞。最初的CHO-K1是在1970年左右，由Puck和Kao的實驗室將原始CHO細胞系的一個亞克隆存放于ATCC（CCL-61），并命名。

隨后源于ATCC CHO-K1的一個亞克隆在1985年被分離，并保存于ECACC（85051005），并被制藥公司和CMO公司用作重組蛋白的表達。最原始的CHO-K1細胞是貼壁培養，并需要添加血清。

Lonza公司從ECACC獲得CHO-K1馴化到懸浮無血清培養后，建立CHO K1SV（Lonza，2002）細胞株，并廣泛應用于其GS表達平臺。

Merck（原SAFC）也是從ECACC獲得CHO-K1細胞株，并懸浮馴化至化學成分限定培養基中，形成了CHOZN® CHO K1（Merck，2006）細胞株。

基于CHO-K1細胞的表達平臺多采用GS（谷氨酰胺合成酶）篩選系統和/或抗生素篩選系統。兩個篩選系統連用，提高篩選效率。目前多個已經上市的治療性蛋白是基于CHO-K1細胞進行開發生產的。

2.CHO-S

基于原始的CHO細胞系，1973年Thompson實驗室分離了一株可用于懸浮培養的CHO細胞，并將此細胞命名為CHO-S。此細胞系在1980年代后期提供給當時的Gibco公司，后者將此細胞馴化至CD CHO培養基中，建庫并以CHO-S名稱進行推廣。

因其能在無血清培養基中懸浮生長，并支持高密度培養，在早期常被用作瞬時表達宿主細胞。此后，相應的GMP細胞庫被建立，并支持商業化授權開發。

3.CHO-DXB11

CHO-DXB11（又名DUK-XB11）是由哥倫比亞大學的 Urlaub和Chasin在1970-80年代通過伽馬射線誘變的方法獲得。

CHO-DXB11細胞的雙等位基因中，一個DHFR基因被敲除，另一個DHFR基因僅包含一個錯義突變（T137R），這使得此細胞不能有效還原葉酸而合成次黃嘌呤（H）和胸苷（T）。在表達外源重組蛋白時，將外源的DHFR基因和目標蛋白基因同時轉染細胞，并通過缺乏HT的培養基進行篩選。

CHO細胞平臺上第一個被批準上市的tPA就是采用DXB11做為宿主細胞，并且此宿主細胞被Genentech用于后續的多個商業化產品生產。

4.CHO-DG44

由于DXB11細胞中僅有一個等位基因被敲除，在長期傳代過程中，會發生低幾率的突變使宿主細胞重新恢復DHFR基因活性，造成篩選壓力的下降甚至導致重組蛋白表達量的下降。因此，獲得一個雙等位DHFR基因完全敲除的宿主細胞成為一個需求。

Chasin實驗室先后通過化學誘變和伽馬射線誘變，最終在1983年篩選出了雙等位DHFR基因敲除的CHO宿主細胞，并命名為CHO-DG44。因為DG44細胞完全缺失了DHFR基因的活性，并且可以無血清懸浮培養，使得篩選和加壓過程變得更加有效。

目前多家公司及CDMO企業采用此細胞做為平臺進行治療性蛋白的開發，已經有多個產品進入臨床及上市階段。

5.CHOK1SV GS-KO

Lonza在其CHOK1SV細胞的基礎上，與Cellectis 合作并利用后者的Meganucleases技術將CHOK1SV細胞中GS的雙等位基因完全敲除，于2012年推出了CHOK1SV GS-KO細胞株。

由于內源性的GS基因被完全敲除，大大提高了篩選效率，縮短了穩定細胞株的開發周期（相比CHOK1SV系統縮短了6周），同時提升了最終克隆的穩定性。基于GS-KO細胞的GS Xceed表達平臺除包括宿主細胞株外，還包括相應的質粒及V8培養基系統。

GS Xceed已經在全球用于多個產品的開發，并向全球授權（Lonza一代CHOK1SV不給中國授權）。但由于V8培養基系統相對復雜，多數CHOK1SV/GS-KO客戶并未采用其培養基系統。

6.CHOZN GS

Merck（原SAFC）于2006年通過ECACC獲得CHO-K1細胞株，并將其馴化至化學成分限定培養基CD Fusion中，然后進行亞克隆建立CHOZN CHO K1細胞系。在此細胞系基礎上，通過ZFN（鋅指核酸酶）技術敲除GS雙等位基因，獲得GS缺陷型細胞株CHOZN GS，并于2012年推向市場。

整個平臺除細胞株外，還包括質粒、克隆構建階段用的培養基及流加工藝平臺培養基。通過平臺化的培養工藝進行細胞篩選，可將穩定細胞株構建及上游工藝開發周期縮減到18個星期。

目前以CHOZN GS做為宿主細胞的多個項目已經在全球多個國家推進到臨床實驗階段。

除了上述在工業界應用較多的細胞系外，還有其他一些CHO細胞系也在應用。如在歐洲應用比較多的Selexis公司SURE CHO-M細胞株，其源于ECACC CHO-K1細胞系，并經馴化后獲得，Selexis表達平臺同時運用MARs元件來提升篩選效率和目標蛋白表達量，運用CHO-M的多個項目已經推進到臨床實驗階段并有一個分子獲得批準上市。

Horizon的HD-BIOP1（GS Null CHO-K1）也是源于ECACC CHO-K1細胞系，通過rAAV技術將雙等位GS基因敲除，獲得GS缺陷型細胞，但由于基因編輯實驗過程中部分實驗關鍵材料記錄不全而引起監管機構的擔心，Horizon試圖通過全基因組測序來消除監管機構的擔心，但由于基因組數據過于龐大以及現在對整個基因組數據的解讀尚需時日，目前為止尚未在歐美國家獲得臨床實驗批準。