蛋白質組學助力腸道屏障功能障礙保護作用機制研究
發表期刊：Food & Function
發表時間：2020年8月19日
影響因子：4.171（中科院分區一區,Top期刊）
合作客戶：江南大學
百趣生物提供服務：Label free非標記定量蛋白質組學
1.研究背景
脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)是食物鏈中常見的真菌毒素之一，廣泛分布于谷物及受污染的食品和飼料中。有較多證據表明其對腸道穩態的毒性有影響，特別是由緊密連接(TJ)、黏附連接(AJ)、縫隙連接和細胞橋粒維持的腸道屏障完整性。山奈酚（KAM）是一種廣泛存在于水果和蔬菜中的天然多酚抗氧化劑，在預實驗中發現KAM是防止DON暴露時Caco-2細胞單層屏障功能失調的最有效試劑。于是采用蛋白質組學方法研究了 KAM預處理對Caco-2細胞模型中由DON誘導的屏障功能障礙的保護作用，從而為降低DON毒性效應的策略的發展提供理論基礎。
2.材料和方法
- 主要技術：Label free非標記定量蛋白質組學
- 樣本類型/分組：
Caco-2細胞：對照組，KAM組，DON組，KAM預處理組（KAM+DON組）
- 檢測平臺：Nano-LC-MS/MS
- 搜庫/定量軟件：MaxQuant
- 數據分析：R、STRING、SPSS
3.技術路線
4.研究結果
1. KAM預處理可改善DON暴露引起的屏障功能障礙
為了尋找預防或干預DON誘導的細胞屏障功能障礙的最佳候選化合物，作者選擇了橙皮素、槲皮素、山奈酚、白藜蘆醇、小檗堿、兒茶素、柚皮素和丁酸鈉等植物化學物質，比較它們對抗DON誘導的屏障功能障礙的效果。結果發現在DON暴露時，KAM是唯一一個經TEER評估對保護細胞屏障功能有顯著作用的物質。與對照組相比，DON處理分別導致TEER和FD-4的通量顯著降低和增加，而經KAM預處理組(KAM + DON)處理后則有明顯改善，表明KAM預處理有效地改善了DON對Caco-2細胞單層屏障功能的損傷，KAM對DON誘導的細胞屏障功能障礙起到保護作用。應用Label free定量蛋白組來全面了解KAM260和DON對細胞屏障功能影響的潛在機制。
圖1 KAM和DON對Caco-2細胞模型的影響(A) TEER和(B) FD-4通量
2. 蛋白組學研究
與對照組相比，KAM組、DON組、KAM預處理組分別鑒定出670個、1295個和1052個差異表達蛋白（DEPs）（圖2），表明KAM和DON處理均顯著影響了Caco-2細胞中蛋白的表達。經KAM預處理后，差異表達的下調和上調蛋白均顯著低于DON組，說明DON影響的蛋白的表達在KAM預處理后被最小化或補償，這表明KAM對Caco-2細胞有潛在的有益作用，盡管DON仍然在KAM預處理組中起主導作用。
圖2 各對比組火山圖和DEPs統計
GO分析顯示三組DEPs均顯著(p<0.05)富集于細胞黏附分子結合(MF)、細胞連接(CC)和細胞連接組裝(BP)，表明KAM和DON均顯著影響細胞屏障功能（圖3）。KEGG分析顯示緊密連接、黏附連接和ECM相關通路在不同處理組中均富集，這證實了DON和KAM對細胞連接的影響。特別值得注意的是DON顯著影響了黏附連接的代謝通路，表明黏附連接(包括細胞-細胞粘附和細胞-基質粘附)也是細胞連接的完整性所必需的（圖4）。進一步分析KEGG富集的兩條代謝通路(緊密連接和黏附連接通路)，KAM預處理通過PKA和MAPK/ERK通路影響緊密連接和黏附連接蛋白的表達和組裝，從而改善對Caco-2細胞單層的屏障功能（圖5）。
圖3 GO富集分析
圖4 KEGG分析
圖5 緊密連接(A)和黏附連接(B)代謝通路及相關蛋白表達(以KAM + DON Vs DON為例)。
3.WB驗證
為了驗證蛋白質組學數據的準確性，作者對參與緊密連接和黏附連接通路的相關蛋白進行了western blot分析。結果表明，KAM預處理顯著提高了受DON不利影響的CLDN4，CDH16和 MAPK1蛋白質的表達，與定量蛋白質組學的結果一致。此外，P-VASP分析顯示，CON顯著降低P-VASP表達，而KAM預處理組則顯著增加其表達水平，表明 KAM預處理通過PKA提高VASP磷酸化水平起到保護作用。
圖6 WB分析
5.研究結論
KAM預處理可通過PKA和MAPK/ERK通路改善DON引起的腸道屏障功能障礙。基于生物活性植物化學物質的營養方法以提高機體的免疫力可能是對抗真菌毒素對腸屏障功能的不利影響的有效策略。
6.文章延伸
百趣生物為本研究提供了Label free非標記定量蛋白質組學檢測分析服務。
Label free非標記定量蛋白質組學是一種不依賴于同位素標記的蛋白質定量技術，該技術通過液質聯用對蛋白質酶解肽段進行檢測，分析大規模鑒定蛋白質時所產生的質譜數據，對被檢測到的離子峰強度進行積分，以積分面積進行相對定量。
Label free非標記定量蛋白質組學技術優勢：
- 無需標記，最大程度的保留樣本的真實性；
- 處理步驟簡單，成本低；
- 不受標簽數量的限制，多個樣本可以同時進行蛋白定量分析。
