如何定量檢測cAMP和cGMP
如何定量檢測cAMP和cGMP
背景介紹
1958年Sutherland發現了cAMP(環磷酸腺苷)，并因此獲得了1971年諾貝爾生理與醫學獎[1]. 1963年Ashman發現了cGMP（環磷酸鳥苷）[2]。50年過去了，人們已明白cAMP、cGMP是在很多生理過程中發揮重要調節作用的第二信使分子。鳥苷酸環化酶可將GTP催化生成cGMP，cGMP可以被磷酸二酯酶水解成GDP。激活鳥苷酸環化酶和抑制磷酸二酯酶可以增加細胞內cGMP的含量。cGMP特異性磷酸二酯酶的抑制劑被用來治療人類的某些疾病，比如cGMP特異性磷酸二酯酶類型5的抑制劑（偉哥和西力士）被用來治療ED（勃起功能障礙）；腺苷酸環化酶將ATP催化生成cAMP，cAMP可以被磷酸二酯酶水解成ADP。激活腺苷酸環化酶和抑制磷酸二酯酶可以增加細胞內cAMP的含量。腺苷酸環化酶激活受體的阻斷劑和cAMP特異性磷酸二酯酶的抑制劑被用來治療人類的某些疾病，比如針對升高cAMP水平的b-腎上腺素受體的阻斷劑被用于治療心律失常、高血壓、心肌梗塞和心力衰竭等疾病。
在五十年的研究歷程中，從開始研究cAMP，cGMP在各種生理過程中的調節作用，到近幾年與之相關的藥物研發，藥物篩選領域，人們一直在努力尋找一種快速、靈敏、特異性和可重復地定量檢測cAMP和cGMP含量的方法。
檢測方法演變
cAMP，cGMP分子量分別只有329.21和345.21，在機體內的含量極低，為p mol/L級別，用一般的分析方法無法測定。70年代一系列測定cAMP和cGMP的方法被發明出來，最基本的原理有三種：分別是競爭性蛋白質結合分析法[3]、放射性免疫分析法[4]和薄層色譜法[5]。在80年代，放射性免疫分析法得到了廣泛的應用和改進，由于這種方法采用放射性核素標記，應用范圍受到一定限制，為了進一步提高檢測的靈敏度和操作的安全性，進入90年代又陸續發明了各種酶標記法和化學發光法的競爭性ELISA檢測試劑盒，這一類檢測方法的根本原理都是基于抗體抗原的免疫反應，所有這些試劑盒中采用的抗體全部是兔抗血清或者是經過特異親和提純之后的抗cAMP或cGMP的兔多抗，毫無疑問，兔多抗在約四十年的cAMP，cGMP定量檢測中做出了巨大貢獻，但同時它也有著明顯的缺陷：
1，兔多抗對cAMP，cGMP的特異性不高，會與其他核苷類似分子發生交叉反應，盡管可以通過特異親和提純降低交叉，但仍然無法消除交叉；
2，兔多抗對cAMP和cGMP的親和力受高濃度的二價陽離子（比如Mg2+和Ca2+）的影響；
3，兔多抗在制備的過程中存在個體差異和批間差異，難以保證檢測數據的重復性；
4，兔多抗試劑盒在cAMP，cGMP樣品的處理上也需要進行乙�；幚�，這與兔多克隆抗體制備方法有必然關系，如果不乙�；瘜o法達到檢測所需的靈敏度。
所以無論標記方法如何革新，不改進抗體，仍然不能從根本上迎來cAMP，cGMP定量檢測的變革。
cAMP和cGMP單克隆抗體成功開發
NewEast Biosciences（紐斯特）公司的科學家經過兩年的研發，篩選了4萬多個克隆，終于從中發現了高特異性，高親和力的cAMP和cGMP單克隆抗體。并成功構建了世界上唯一的基于單抗的cAMP和cGMP ELISA檢測試劑盒。這個cAMP（cGMP）單抗對非乙�；腸AMP（cGMP）的特異性識別能力是其對cGMP（cAMP）、ATP（GTP）以及其他核苷類似物識別能力的108倍以上，這相比于以往的多抗試劑盒大大提高了cAMP (cGMP) 檢測的靈敏性和特異性，并且極大的降低了試劑盒的批間差異，提供了長久有效地可重復性檢測，也徹底擺脫了繁瑣的乙酰化過程和對科研人員健康不利的乙�；瘬]發試劑。
該試劑盒一經推出，得到了學術界的廣泛認可，幾年來陸續發表論文十多篇。
已發表論文：
1. Castro, L. R., J. Schittl, et al. (2010). "Feedback control through cGMP-dependent protein kinase contributes to differential regulation and compartmentation of
cGMP in rat cardiac myocytes." Circ Res 107(10): 1232-1240.
2. Guo, D., J. J. Zhang, et al. (2009). "Stimulation of guanylyl cyclase-D by bicarbonate." Biochemistry 48(20): 4417-4422.
3. Long, Y., Q. Li, et al. (2011). "Molecular analysis, developmental function and heavy
metal-induced expression of ABCC5 in zebrafish." Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 158(1): 46-55.
4. Tseng, K. Y., A. Caballero, et al. (2011). "Inhibition of Striatal Soluble Guanylyl Cyclase-cGMP Signaling Reverses Basal Ganglia Dysfunction and Akinesia in Experimental
Parkinsonism." PLoS One 6(11): e27187.
5. Zhang, Y., Y. Sun, et al. (2011). "Molt-inhibiting hormone from Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis): Cloning, tissue
expression and effects of recombinant peptide on ecdysteroid secretion of YOs." Gen
Comp Endocrinol 173(3): 467-474.
6. Zheng, X., L. Ying, et al. (2011). "Role of sulfhydryl-dependent dimerization of soluble guanylyl cyclase in relaxation of porcine coronary
artery to nitric oxide." Cardiovasc Res 90(3): 565-572.
7. Tsai, E. J., Y. Liu, et al. (2012). "Pressure-overload-induced subcellular relocalization/oxidation of soluble guanylyl cyclase in the heart
modulates enzyme stimulation." Circ Res 110(2): 295-303.
8. Andre, L., J. Fauconnier, et al. (2012). "Subendocardial Increase in Reactive Oxygen
Species Production Affects Regional Contractile Function in Ischemic Heart Failure."
Antioxid Redox Signal.
9. Makiya, M., M. Dolan, et al. (2011). "Structural basis of anthrax edema factor
neutralization by a neutralizing antibody." Biochemical and Biophysical Research
Communications. ???
10. Skrabalova, J., J. Neckar, et al. (2012). "Antiarrhythmic effect of prolonged morphine
exposure is accompanied by altered myocardial adenylyl cyclase signaling in rats."
Pharmacol Rep 64(2): 351-359.
11. Ying, L., X. Xu, et al. (2012). "Heterogeneity in relaxation of different sized porcine
coronary arteries to nitrovasodilators: role of PKG and MYPT1." Pflugers Arch 463(2): 257-268.
參考文獻:
1, Sutherland, et al. Cyclic AMP. Academic Press. Science 174, 392 (1971).
2, Ashman, et al, Biochem Biophys Res Commun, 11, 330 (1963).
3, Honma, M. et al., Biochem. Med.,18, 257 (1977).
4,Goldberg, M. L., Clin. Chem., 23, 576 (1977).
5, Trifilo, R. M. et al., J. Chromatogr., 116, 465 (1976).
