生長激素釋放因子ELISA試劑盒
生長激素釋放因子ELISA試劑盒
（美國DRG原裝進口，貨號：EIA3429 ）
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預期用途
此試劑盒基于競爭酶免法檢測特異性多肽和相關多肽。
實驗原理
微孔板預包被有第二抗體，非特異性結合位點封閉，主要抗體的Fab片段競爭結合生物素標記的多肽和標準品或樣本中的目的多肽，二抗則與Fc片段結合。生物素標記的多肽與HRP-鏈霉親和素反應，催化底物反應，黃色強度直接與生物素標記多肽-HRP-鏈霉親和素復合物的量成正比，但是與標準品或樣本中的多肽量成反比。根據已知濃度建立標準曲線，樣本中未知濃度的多肽濃度可直接從標準曲線上讀取。
試劑盒組成
20X的緩沖濃縮液，50ml
- 微孔板，96孔
- 封板紙
- 主要抗血清，兔抗多肽IgG，1支
- 標準品，1支
- 生物素標記多肽，1支
- HRP-鏈霉親和素，30ul
- 陽性質控，2支
- 底物液，12ml
- 終止液，2N鹽酸，15ml
- 坐標紙
- 說明書
實驗所需材料（但試劑盒未提供）
酶標儀（450nm）
- 振蕩器，300-400rpm
- 洗板系統
- 多通道移液器，50-100ul
- 溶液貯存瓶
- 吸水紙
- 采血管（可選）
- 抑肽酶，0.6TIU/ml血液（可選）
- 緩沖液A（可選）
- 緩沖液B（可選）
- C18分離柱
注意：打開試劑和試驗開始前先將其平衡至室溫（20-23℃），強烈建議稀釋過的溶液盡快使用，采血步驟見盒子內的采血說明書，每個盒子所含成分足夠用于96人份檢測或40人份的雙孔檢測。
實驗步驟
實驗前認真閱讀說明書，所有試劑平衡至室溫（大約25-45min）
- 用950ml的去離子水稀釋20X的緩沖濃縮液，得到1X的試驗緩沖液，用于稀釋其他試劑和樣本。注意：如果20X的緩沖液出現了結晶，可在水浴鍋內加熱使其完全溶解，使用前徹底混勻
- 用1X的緩沖液稀釋，離心標準品，振蕩。Stock solution的濃度為1000ng/ml，室溫下放置至少10min，至完全溶解。使用前離心，振蕩。標準品準備如下
編號 標準品的量 緩沖液的量 濃度
Stock 1000ul ---- 1000ng/ml
#1 100ul的Stock 900ul 100 ng/ml
#2 100ul的#1 900ul 10 ng/ml
#3 100ul的#2 900ul 1ng/ml
#4 100ul的#3 900ul 0.1 ng/ml
#5 100ul的#4 900ul 0.01 ng/ml
- 用5ml的1X的緩沖液稀釋主要抗體，放置至少5min，至完全溶解，徹底混勻
- 用5ml的1X的緩沖液稀釋生物素標記多肽，放置至少5min，至完全溶解，徹底混勻
- 200ul的1X緩沖液稀釋質控，放置至少5min，至完全溶解，徹底混勻
- 將A1和A2孔作為空白對照（Blank）
- 在B1和B2孔內加50ul的1X緩沖液，作為Total Binding
- 將配制好的標準品由#5到#1各50ul依次加入至C1和C2—G1和G2孔內，注意，標準品需做雙份檢測
- H1和H2孔加入50ul已稀釋的陽性質控，注意，陽性質控也要做雙孔檢測
- 將50ul樣本加入至相應孔內，做雙孔檢測
- 除空白孔外（Blank well），每孔加25ul的已稀釋的主要抗體
- 除空白孔外（Blank well），每孔加25ul的已稀釋的生物素標記多肽，注意，不建議生物素標記多肽或主要抗血清加樣時使用多通道移液器
- 蓋板，室溫，300-400rpm下孵育2小時
- 在3000-5000rpm下將HRP-鏈霉親和素離心5秒，然后取12ulSA-HRP和12ul 1X的緩沖液混勻
- 移取蓋板，倒去反應液
- 每孔350ul 1X緩沖液洗板4次，吸水紙上拍干
- 每孔加100ul的SA-HRP
- 蓋板，室溫，300-400rpm下孵育1小時
- 移取蓋板
- 同步驟17）
- 每孔加100ul的TMB底物液
- 蓋板，室溫，300-400rpm下孵育1小時
- 移取蓋板，每孔加100ul的2N 鹽酸終止反應。溶液顏色由藍色變黃色，如未出現統一的顏色變化，用手輕輕拍板，使其徹底混勻，20分鐘內進行下一步驟
- 酶標儀450nm處讀數
結果計算在半對數坐標紙上繪制標準曲線。標準品的濃度為X軸，相應的OD值為Y軸，用四參數或對數-對數法繪制最合適的標準曲線。濃度與OD值成反比關系，隨著標準品濃度的增加，黃色強度就減少，即OD值減少
樣本濃度可直接從標準曲線上讀取。如果樣本實驗前進行了稀釋，則最后結果應乘以相應的稀釋因子
標準曲線為逆向S型曲線
附：采用全自動酶標儀檢測，只需檢測前設置好酶標儀的相關參數，如坐標參數（線性，半對數）和計算方式參數（三次回歸、四參數或雙對數曲線方程），即可直接得到結果。
貯存
收到貨后貯存于4℃
- 強烈建議盡快使用配制的試劑
- 1X緩沖液貯存于4℃
- 將不用的微孔板放回至密封袋內密封起來，貯存于4℃
- 已稀釋的標準品，生物標記物，抗體和HRP貯存于4℃
樣本采集的建議
血液采集
用含有EDTA的采血管采集血液，每管可裝7ml，采到了抗凝血液后立即搖晃幾次，將血液從采血管轉至含抑肽酶的離心管，不斷搖晃，抑制蛋白酶活性，1600xg轉速，4℃下離心15min，，收集血漿，血漿樣本可在-70℃下保存1個月。如果采血管可用于離心，可直接將抑肽酶加入至采血管內。
血漿中提取多肽
- 用等量的緩沖液A酸化血漿，如1ml的血漿加入1ml的緩沖液A，混勻，6000-17000xg下，4℃離心20min
- 分離柱內含200mg的C18，依次用緩沖液A（3ml ，3次）和緩沖液B（1ml，1次），使其平衡
注意：步驟3-5中不能對分離柱施加任何壓力
- 將酸化的血漿倒入至預平衡的C18分離柱內
- 用緩沖液A（3ml，2次）慢慢洗柱，倒去洗液
- 用緩沖液B（3ml，1次）慢慢洗提多肽，收集至塑料管內
- 用離心濃縮機或其他方法將洗提液蒸干
- 將抽提物直接貯存于-20℃，并盡快進行試驗，用1X的緩沖液直接配制。如果多肽濃度不在檢測范圍內，就直接進行稀釋或濃縮
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