5-羥基吲哚乙酸（5-HIAA） ELISA試劑盒使用說明

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5-羥基吲哚乙酸（5-HIAA） ELISA試劑盒使用說明

（德國IBL：RE59131）

1、應用范圍

此ELISA試劑盒可用于人尿液中5-HIAA的體外定量檢測。

2、前言

原發性類癌瘤通常都源自中腸的腸嗜鉻細胞，并且大多情況都位于回腸末端中。類癌瘤通常都會分泌各種各樣的吲哚，此類腫瘤的一般都明顯的表現為尿液5-HIAA（五羥色胺的最終代謝產物）的分泌量升高。5-HIAA傳統的檢測方法是通過亞硝基萘酚的重氮化作用產生紫色。然而，人們已證明很多存在于尿液中的其它物質會干擾此反應而出現假陽性結果。人們也嘗試著通過將離子交換層析和熒光分析相結合的方法來克服此問題。但這些方法靈敏度低并且耗費時間。最近，有人也介紹使用下列方法來檢測5-HIAA：紫外區域5-HIAA的高效液相層析與熒光分析（或電化學分析）相結合的方法。因為尿液中存在著各種各樣的干擾復合物，所以這兩種方法都要求進行溶劑提取。而5-HIAA的酶聯免疫檢測是用于尿液中類腫瘤綜合征標記物定量檢測的一種全新的、簡單的方法。

3、實驗原理

此ELISA試劑盒利用的是競爭法原理，生物素標記抗原和未用生物素標記抗原競爭結合一定量的抗體結合位點。結合到抗體上生物素標記抗原的量與樣品中被分析物的濃度成反比。反應系統達到平衡后，未結合的生物素標記的抗原用洗滌液洗去。結合了生物素標記抗原的抗體的量的測定是以抗生物素堿性磷酸酶作為標記物，以PNPP(對硝基苯酚磷酸鹽)作為底物液。將未知物的酶反應活性和已知標準品的反應曲線相比較，可以得到未知物的量。

4、試劑盒成分

數量	標志	成分
1×12×8	MTP	包被板，可拆，微孔中包被了抗兔IgG（羊，單克�。�。
1×5ml	ANTISERUM	5-HIAA 抗血清藍色，即用，內含：抗血清（兔），磷酸緩沖液，穩定劑。
1×5ml	BIOTIN	5-HIAA 生物素即用，藍色，內含：磷酸緩沖液，穩定劑。
1×0.2mL	ENZCONJ CONC	酶聯物濃縮型（100×）內含：堿性磷酸酶標記的抗生物素抗體（羊），Tris緩沖液，穩定劑
1×7×0.5ml	CAL A-G	標準品A-G 0; 0.4; 1.0; 2.75; 7.5; 20; 55 mg/L 0; 2.1; 5.25; 14.4; 39.4; 105; 288 μmol/L 即用,內含:5-HIAA（甲基化）,穩定劑。
1×2×0.5ml	CONTROL 1+2 LYO	質控品1+2，凍干粉，內含：人尿液（正常與非正常人的尿液），具體濃度及可允許范圍請見試劑瓶標簽.
1×2ml	METHYLRAGE	甲基化試劑，黃色，即用，內含二氯甲烷
1 x 1 mL	HCL	HCl，即用，0.1M的HCl
1 x50ml	ASSAUBUF CONC	檢測緩沖液，濃縮（10 x）內含：磷酸緩沖液，BSA，穩定劑
1 x4ml	DILREAG	稀釋液，即用，內含：N,N-二甲基甲酰氨
1 x50ml	WAHSBUF CONC	洗滌液，濃縮（20 x）內含：磷酸緩沖液，吐溫，穩定劑
1×9	PNPP SUBS	PNPP底物片，內含：對硝基苯磷酸（PNPP）
1×27ml	PNPP BUF	PNPP底物緩沖液，即用，內含：二乙醇胺，水，
1×15ml	PNPP STOP	PNPP終止液，即用，內含：1M的NaOH，0.25M的EDTA
3×	FOIL	粘性金屬板

5、實驗所需器材（但試劑盒不提供）

移液器（20；25；50；100；1000μL）

玻璃檢測用試管（12×75mm）

旋渦混合器

帶儲器的8通道移液器

洗滌瓶，自動或半自動包被板清洗系統

酶標儀

雙蒸水或去離子水

通風櫥

吸水紙，取樣吸頭，計時器

6、實驗前的準備說明

供手動操作和自動操作用：

注意	此96人份的檢測試劑可分成3次獨立的實驗進行。下列體積為用四條包被板（32人份）進行一次檢測所需要的試劑的量。如果客戶想將標準品的量由7個減為6個，您可去掉標準品G。則實驗結果的報告范圍相應的減少到3000μg/L

6.1凍干粉或濃縮成分的制備

稀釋	成分		稀釋液	比例	備注	貯存	穩定性
15ml	檢測緩沖液	150ml	雙蒸水	1：10	充分混合	2-8℃	2周
	炙控品	0.5ml	0.1M的HCl		靜置15min，混合時避免氣泡	≤-20℃	8周
15ml	洗滌液	300ml	雙蒸水	1：20	加熱至37℃以溶解所有的晶體（如果有必要），充分溶解。	2-8℃	4周
60μL	酶聯物	60ml	檢測緩沖液(已稀釋好)	1：101	臨時配置，僅能使用一次，混合時避免氣泡產生	18-25℃	30min
3	PNPP底物片	8ml	PNPP底物液緩沖液		臨時配置，僅能使用一次,混合時必免氣泡產生	18-25℃	10min

6.2樣品的稀釋

樣品中5-HIAA膿渡高于最高標準品的應在甲基化后用檢測緩沖液進行進一步的稀釋。

7、第一天

7.1質控品和病人樣品的稀釋（除標準外）

樣品的準備將導致255倍的稀釋。但這已將此考慮到標準品濃渡中。

注意	不要甲基化標準品，它已經被甲基化了。
1）	將質控品和樣品分別20μL加入到相應的玻璃試管中。
2）	完成次操作步驟后，請在通風櫥內繼續操作。
3）	在每一支試管中加入50μL稀釋液。旋渦混合器上混合。
4）	在每一試管中加入25μL甲基化試劑。加入試劑后立即混合試管內溶液。注意：反應混合物的黃顏色應當持續穩定，如果顏色迅速消失說明樣品中酸的量過大。在這種情況下在向試管中加20μL甲基化試劑。
5）	蓋好試管，室溫（18-25℃）下溫育20min
6）	在每一試管中加入5ml已稀釋好的檢測緩沖液。用塞子蓋好是試管并旋轉幾次。手動或用混合器上下混合最少五次，以便液體能充分混合。
7）	完成此步驟后就可以不要才通風櫥下操作了。
8）	吸取50μL上清液，立即進行ELISA實驗。上清液室溫下可穩定存放1h。

8.2 ELISA操作

1）	將標準品、甲基化質控品和甲基化病人樣品分別50μL加入到相應的微孔。
2）	在每一微孔中加入50μL 5-HIAA生物素。
3）	在每一微孔中加入50μL 5-HIAA抗血清。
4）	蓋板，小心振動包被板。2-8℃下溫育一夜（16-20h）。

8、第二天

1）	移去金屬板，棄取孔內反應液，用250μL洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干。
2）	每孔加入150μL臨時配置好的酶聯物
3)	用一新的粘性金屬蓋板。室溫環境（18-25℃）下，在軌道搖床（500rpm）上溫育120min.
4)	在溫育結屬前大約10min的樣子時，向微孔中加入酶聯物。
5）	移去金屬板，棄去孔內反應液，用250μL已稀釋好的洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干。
6）	在加入底物液和終止液時，如果有條件的話，可使用8道移液器進行加液。加底物液和終止液必須按相同的時間間隔進行，避免氣泡產生。
7）	在每一微孔中加入200μL臨時配置好的PNPP底物液。
8）	室溫（18-25℃）環境下，在軌道搖床上溫育60min。
9）	在每一微孔中加入50μL PNPP終止液以終止反應。輕輕搖動包被板以混合各種成分。
10）	加入終止液后60min之內在405nm處測OD值（參考波長：600-650nm）。