圓二色譜（遠(yuǎn)/近紫外）

——即蛋白質(zhì)藥物的圓二色譜分析技術(shù)服務(wù)

目前研究蛋白質(zhì)、多肽的二級(jí)及高級(jí)結(jié)構(gòu)的方法有幾種，如X-ray晶體衍射技術(shù)、核磁共振技術(shù)和圓二色譜技術(shù)等。前兩種方法較復(fù)雜，并且受很多因素影響，分析起來(lái)比較困難。相對(duì)而言，圓二色譜是一種比較簡(jiǎn)單且有效的技術(shù)，也是目前研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要手段之一。

圓二色譜儀的工作原理是：利用蛋白質(zhì)的圓二色性及不對(duì)稱分子對(duì)左右圓偏振光吸收的不同來(lái)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。蛋白質(zhì)或多肽中主要的光活性基團(tuán)是肽鍵、芳香氨基酸殘基及二硫鍵等，當(dāng)平面圓偏振光的吸收不相同時(shí)，會(huì)產(chǎn)生吸收差值。由于這種吸收差的存在，造成了偏振光矢量的振幅差，圓偏振光變成了橢圓偏振光，即蛋白質(zhì)的圓二色性。通過(guò)圓二色譜掃描儀，可以在一定程度上分析蛋白質(zhì)、多肽樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)。

“蛋白質(zhì)多肽的圓二色譜分析對(duì)于研究二級(jí)和高級(jí)結(jié)構(gòu)非常有意義”

技術(shù)指標(biāo)

圓二色譜分析的供試品，大多數(shù)情況下的蛋白質(zhì)和多肽。蛋白質(zhì)的精確濃度是計(jì)算樣品二級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵，一般要求樣品濃度為0.2μg/μl，濃度過(guò)高，測(cè)試時(shí)信號(hào)不好，需稀釋，樣品純度要在90%以上，不要添加任何保護(hù)劑或其它物質(zhì)，樣品中應(yīng)避免含有光吸收的雜質(zhì)，緩沖劑和溶劑在配制溶液前最好做單獨(dú)的檢查，透明性極好的磷酸鹽可用作緩沖體系。

圓二色譜在遠(yuǎn)紫外區(qū)的掃描圖譜，反映的是蛋白質(zhì)肽鍵的排布信息，計(jì)算所得的是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)比例，即α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲的比例。

圓二色譜在近紫外區(qū)的掃描圖譜，反映的是蛋白質(zhì)側(cè)鏈生色基團(tuán)色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等殘基的排布信息和二硫鍵微環(huán)境的變化。

案例分析

下圖分別為蛋白質(zhì)樣品和其對(duì)照品在遠(yuǎn)紫外區(qū)和近紫外區(qū)的Overlay圖。

圖為蛋白類供試品的遠(yuǎn)紫外Overlay圖譜（藍(lán)色代表樣品，綠色代表對(duì)照品）

圖為蛋白類供試品的近紫外Overlay圖譜（藍(lán)色代表樣品，綠色代表對(duì)照品）

樣品及其對(duì)照品的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量分析結(jié)果如下圖，兩者的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量相似。

結(jié)果：樣品和對(duì)照品的遠(yuǎn)、近紫外區(qū)的圓二色譜圖，經(jīng)Overlay處理后圖譜基本重疊；遠(yuǎn)紫外區(qū)的圓二色譜圖經(jīng)過(guò)分析二級(jí)結(jié)構(gòu)后，各種二級(jí)結(jié)構(gòu)含量也基本一致，說(shuō)明樣品和對(duì)照品具有一致的二級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)。

Q&A

1)     圓二色譜的解讀。

圓二色譜技術(shù)能快速、簡(jiǎn)單、較準(zhǔn)確地研究溶液中蛋白質(zhì)和多肽的構(gòu)象，并且運(yùn)用斷流、電化學(xué)等附加裝置，結(jié)合溫度、時(shí)間等變化參數(shù)，已經(jīng)廣泛用于了解蛋白質(zhì)-配體的相互作用，監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)分子在外界條件誘導(dǎo)下發(fā)生的構(gòu)象變化，探討蛋白質(zhì)折疊、失活過(guò)程中的熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)等多方面的研究。

2)     圓二色譜分析的軟件介紹。

圓二色譜在遠(yuǎn)紫外區(qū)的掃描圖譜，反映的是蛋白質(zhì)肽鍵的排布信息，計(jì)算所得的是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)比例；圓二色譜在近紫外區(qū)的掃描圖譜，反映的是蛋白質(zhì)側(cè)鏈生色基團(tuán)色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等殘基的排布信息和二硫鍵微環(huán)境的變化。

目前用于拆分和估算的軟件不下十幾種，得到研究者廣泛認(rèn)同的計(jì)算模式有幾種，但由于不同計(jì)算模式的理論基礎(chǔ)不同，所計(jì)算得到的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)比例并不完全相同，但多數(shù)軟件對(duì)α-螺旋的估計(jì)還是比較準(zhǔn)確的。APT采用JWSSE32軟件對(duì)樣品和對(duì)照品的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行擬合計(jì)算，參考標(biāo)準(zhǔn)曲線采用軟件自帶的標(biāo)準(zhǔn)α-螺旋（α-helix）、β-折疊（beta-pleated sheet）、轉(zhuǎn)角（turn）和不規(guī)則卷曲（random coil）曲線。由于本預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)可能存在誤差，僅供參考之用。