實驗室小量 His 標簽蛋白純化的填料選型參考

His標簽由多個組氨酸殘基構成（一般為6到10個，6個最為常見）。由于組氨酸上的N原子能夠與某些過渡金屬離子形成配位鍵，所以利用這一特性，可以使用含有金屬離子配基的填料來捕獲和純化His標簽重組蛋白。His標簽分子量小，對重組蛋白的性質影響很小，一般情況下不需要切除；而且成本較低，易于表達，是目前最常用的蛋白質標簽。
 
重組肽HIV疫苗在大腸桿菌中的表達、純化和復性
肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor， HGF)是一類多功能生長因子，具有刺激血管增生作用，通過局部肌肉注射攜帶 HGF 基因的質粒 DNA 可明顯促進肢體急性缺血部位新生血管的形成，在臨床上具有治療缺血性疾病的應用前景Zhang等對質粒 pUDK-HGF大規模純化工藝248 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech February 25, 2011 Vol.27 No.2 Journals.im.ac.cn進行了大量研究，工藝成熟，能生產藥用級重組質粒pUDK-HGF 注射液。其工藝是堿裂解后離心處理獲得澄清堿裂解液，直接用 Q-Sepharose XL 陰離子交換層析捕獲質粒 DNA；再用Sephacryl S-1000分離除去RNA；用Source15Q 對質粒 DNA 進行精 制。隨著新填料plasmidselect的出現，生產超螺旋質粒DNA的工藝隨之更新，因此本文建立新的pUDK-HGF 純化工藝，該工藝為堿裂解細菌后，用綢布濾去細胞碎片等絮凝物，獲得堿裂解上清液；上清液經300 kDa超濾柱進行濃縮，獲得的濃縮液經Sephacryl S-1000 層析柱除去 RNA，然后通過plasmidselect 層析柱對超螺旋質粒DNA進行捕獲，獲得高純度的超螺旋質粒DNA，再通過瓊脂糖凝膠6BFF對超螺旋質粒 DNA 進行脫鹽；最終采用異丙醇沉淀質粒 DNA，75％乙醇洗滌，配方溶液重溶獲得產品。
 
變性包涵體通過0.45µm濾膜（Millipore，Billerica，USA）以去除聚集體。將濾液加載到5mL HisTrap FF柱（Ni Sepharose 6 Fast Flow，GE healthcare，Fairfield，USA）上，該柱用含有50mM咪唑的緩沖液A平衡。HisTrapFF的結合容量為每毫升包裝200毫克。用平衡緩沖液洗滌未結合的蛋白質。用緩沖液a中的500mM咪唑以15CV/h的流速洗脫結合的蛋白質，然后根據在線紫外檢測器（ZHD，志明生物，中國南京）測定的洗脫液吸光度收集結合的蛋白質。用30%飽和（NH4）2SO4沉淀含有靶蛋白的級分以除去咪唑。在3500g離心30分鐘后，收集蛋白質沉淀并在緩沖液A中再溶解。然后將再溶解的蛋白質溶液加載到含有陽離子交換劑（5mL Hitrap CM FF，GE healthcare，Fairfield，USA）的色譜柱上，其結合容量為250mg/mL填料。加載和洗滌后，用含有0.1-1M NaCl線性梯度的緩沖液A以20CV/h的流速洗脫結合的蛋白質。 為了進一步提高目標蛋白的純度，使用具有Ni Sepharose High Performance（GE healthcare，Fairfield，USA）的5mL HisTrap柱純化重組蛋白疫苗。HisTrap HP的結合容量為每毫升包裝200毫克。與HisTrap FF柱上的過程類似，用含有100-500mM咪唑的緩沖液A以15CV/h的流速洗脫與Draft結合的蛋白質。在變性條件下逐步純化重組蛋白
 
Cytiva（思拓凡）  ——Ni Sepharose 6 Fast Flow填料
思拓凡的Ni Sepharose 6 Fast Flow 是一種基于高度交聯瓊脂糖（6% Agarose）的金屬螯合親和層析（IMAC）填料，粒徑約為90 μm，表面偶聯亞氨基二乙酸（IDA）配基并穩定螯合鎳離子（Ni²⁺）。該填料專為從細胞裂解液、發酵液或培養上清中高效純化帶有組氨酸標簽（His-tag）的重組蛋白而設計，廣泛應用于生命科學研究、生物制藥工藝開發及大規模生產。 填料具有優異的化學穩定性和機械強度，可在高流速下運行，適用于重力流層析、FPLC系統（如AKTA）以及工業級層析平臺，支持從小試到放大的無縫工藝轉移。
產品特點
• 高動態結合載量：對典型His-tag蛋白結合能力可達40 mg/mL以上，提升純化效率
• 優越的流速性能：耐受高流速，縮短純化周期，提高處理通量
• 高回收率與純度：特異性強，可有效去除宿主蛋白、核酸等雜質
• 即用便捷：提供散裝填料及多種預裝柱形式，減少操作步驟
• 可放大性強：從實驗室研究到GMP生產均可適用，支持工藝驗證
• 批次穩定性好：嚴格質控確保性能一致，適合長期項目使用  核心功能
• 特異性捕獲帶有單個或多聚組氨酸標簽的重組蛋白
• 實現目標蛋白的快速、高效富集與初步純化 • 支持批量（batch）和柱上（column）兩種純化模式
• 可重復使用，降低實驗成本
• 兼容常見變性劑（如尿素、胍鹽），適用于包涵體蛋白純化  
應用場景
• 大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞表達系統的His-tag蛋白純化
• 蛋白質結構與功能研究前的樣品制備
• 高通量篩選與自動化純化（如96孔板格式）
• 抗體、疫苗、基因治療載體相關蛋白的工藝開發
• 生物藥中試與大規模生產中的捕獲步驟  應用范圍
• 科研領域：高校、研究所的分子生物學、結構生物學、細胞工程等實驗室
• 生物制藥：重組蛋白藥物、單克隆抗體、融合蛋白、酶制劑的開發與生產
• 診斷試劑開發：功能性抗原/抗體的制備
• 工業酶與生物催化：工業用酶的純化與優化  Ni Sepharose 6 Fast Flow 作為Cytiva（原GE Healthcare）經典親和填料，是組氨酸標簽蛋白純化的行業金標準，為用戶提供可靠、高效、可放大的純化解決方案，助力用戶加速從實驗室到臨床的轉化進程。 Cytiva（思拓凡） ——Ni Sepharose High Performance 填料
Ni Sepharose High Performance（HP）是一款以高度交聯的瓊脂糖為基架、鎳離子螯合基團作為配基的親和層析填料。與另外兩款填料相比，它具有最小的粒徑（34 μm），所以使用HP填料進行純化時，可以得到更高的分辨率，樣品的純度也會得到顯著提高，適合用于對純度有較高要求的實驗。
Ni Sepharose High Performance 鎳離子 IMAC 填料用于高分辨率純化帶組氨酸標簽的蛋白，具有高結合載量，可實現最大回收率。
• 高分辨率 – 粒徑小（平均粒徑為 34 µm）。
• 高結合載量可實現高蛋白回收率 — 每毫升填料可回收超過 40 mg 帶組氨酸標簽的蛋白。 • 相容多種試劑 — 耐受各種還原劑、去污劑、變性劑和其他添加劑。  
用于回收帶組氨酸標簽的蛋白的鎳層析填料，具有較高的回收率
Ni Sepharose High Performance (HP) 親和填料由其上偶聯有螯合基團的高度交聯的瓊脂糖基架組成。該螯合基團預裝有鎳，可選擇性地保留帶有裸露組氨酸基團的蛋白。
該 IMAC 填料的結合載量達到 40 mg/mL 以上，可實現高蛋白回收率。與大基架尺寸相比，基架尺寸小的鎳層析填料純化效率更高。
成功用于已發表研究
這種親和層析填料可用于以下方面：
• 純化帶組氨酸標簽的蛋白，用于研究轉錄調節因子如何寡聚體化
• 在 Q Sepharose FF 填料串聯程序中分離包涵體中的重組 HIV-1 蛋白酶   
兼容性空柱
Cytiva 提供多種可供客戶按需填充的空柱。Ni Sepharose High Performance 適用于 HiScale、Tricorn 和 XK 空柱。
便捷的預填充柱
Ni Sepharose High Performance 填料有以下預裝柱規格產品可選：
• HisTrap HP 層析柱：HiTrap 規格（1 mL 或 5 mL），便于與注射器、蠕動泵或層析系統配合使用。
• His SpinTrap：離心柱，用于使用臺式離心機進行小樣本量篩選。
• His MultiTrap HP：96 孔板，用于使用離心機或真空設備進行高通量篩選和小規模純化。
• His Mag Sepharose Ni 磁珠：設計用于小規模純化和篩選。   
其他 IMAC 親和層析填料和層析柱
Cytiva 的解決方案包括各種含鎳填料和其他 IMAC 產品。提供多種選擇，包括高純度、高分辨率、可直接上樣細胞培養上清液和未澄清大腸桿菌裂解物，并可共價偶聯您所需的金屬離子。 在學校實驗室小量 His 標簽蛋白純化的應用場景里， Cytiva 的 Ni Sepharose 6 Fast Flow 和 Ni Sepharose High Performance 兩款填料憑借鮮明的性能優勢，成為實驗室的優選方案。Ni Sepharose 6 Fast Flow 兼顧純化效率與操作實用性，適配多種純化模式和表達系統，能輕松滿足常規小量純化的基礎實驗需求；而 Ni Sepharose High Performance 則以高分辨率和高回收率為核心亮點，精準契合對蛋白純度有嚴苛要求的科研場景。從基礎的蛋白樣品制備，到深入的分子機制研究，這兩款填料都能為實驗室 His 標簽蛋白純化工作筑牢技術基礎，幫助科研人員高效推進實驗進程，為生命科學領域的研究探索提供有力的技術支撐。