線蟲研究相關(guān)工作指南：利用顯微鏡推動發(fā)育、衰老、神經(jīng)科學(xué)等研究

本指南概述了可以高效進行 線蟲 研究的顯微鏡技術(shù)。線蟲是一種廣泛使用的模式生物，與人類有大約 70% 的基因同源性，是研究發(fā)育、神經(jīng)科學(xué)、遺傳學(xué)和衰老的理想生物。它的透明性和易培育性使其成為一個出色的遺傳學(xué)模型系統(tǒng)。它可以進行高分辨率成像。主要的實驗方法包括揀蟲、轉(zhuǎn)基因、熒光篩選、成像和記錄。
 
 
顯微鏡和線蟲研究
顯微鏡是研究線蟲的必備工具。在這些步驟中都會用到它們：

1. "揀蟲"：用金屬挑針從瓊脂平板上挑出蟲子，轉(zhuǎn)移到新的平板上進行培養(yǎng)或?qū)嶒?/li>
2. 通過向線蟲體內(nèi)顯微注射核酸進行轉(zhuǎn)基因（基因改造）
3. 熒光篩選，鑒定表達轉(zhuǎn)染熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因線蟲
4. 在實驗過程中對線蟲（從胚胎到成蟲的所有階段）進行成像和記錄。

這些任務(wù)通過體視顯微鏡、復(fù)合顯微鏡或共聚焦顯微鏡來完成。
 

Cells from C. elegans expressing the fluorescent proteins SPD5-GFP indicating a centriole marker (green) and Histon 2B-Cherry indicating nuclei (red). The 2 pairs of centrioles in the interphase cells are marked with white arrows. The image is the maximum projection of a Z-stack after ICC (instant Computational Clearing) and SVCC (small volume Computational Clearing).
 
   
揀蟲
要 "挑選 "具有適當(dāng)表型或轉(zhuǎn)基因的個體秀 麗隱桿 線蟲，或?qū)⒕�蟲從一個平板移到另一個平板，研究人員需要使用立體顯微鏡和一個末端帶有金屬尖端的小工具。
 
與揀蟲有關(guān)的挑戰(zhàn)有

• 對比度不夠好時，難以識別線蟲的關(guān)鍵解剖細節(jié)
• 長時間揀蟲會造成用戶疲勞
• 用工具處理線蟲時，顯微鏡物鏡下沒有足夠的空間
• 視野不夠大時，找蟲子很麻煩。

不過，徠卡顯微鏡具有以下優(yōu)勢，可以克服這些挑戰(zhàn)：

• 配備各種對比方法的透射光底座可實現(xiàn)高光學(xué)對比度，從而觀察到蟲體細節(jié)
• 采用人體工程學(xué)模塊，用戶安裝舒適，減少勞累和疲勞
• 物鏡下方空間充足，工作距離可達 122 毫米
• 視野更大，更容易發(fā)現(xiàn)線蟲。

 

Many C. elegans roundworms on an agar plate, as could be the case during worm picking.
 
 
顯微注射轉(zhuǎn)基因
秀麗隱桿 線蟲的轉(zhuǎn)基因通常是通過核酸顯微注射完成的。顯微注射通常使用配有注射裝置的倒置復(fù)合顯微鏡進行。
 
對 線蟲 進行顯微注射面臨著一些挑戰(zhàn)：

• 對比度不足，無法觀察到線蟲的精細解剖細節(jié)，而這正是進行適當(dāng)靶向定位所必需的。
• 沒有足夠的空間使用微型注射器
• 設(shè)置不穩(wěn)定時振動太大。

為了克服這些挑戰(zhàn)，用戶可以利用徠卡顯微鏡提供的優(yōu)勢：

• 光學(xué)對比方法，如 DIC（微分干涉對比）或 IMC（集成調(diào)制對比），可清楚地看到注入線蟲的位置
• 抗震裝置（防震裝置）穩(wěn)定可靠
• 能夠使用精確的操作器（Narishige 或 Eppendorf）進行微量注射。

 

Transgenic C. elegans worm expressing GFP (green fluorescent protein). Thunder image courtesy of L. Ma, School of Life Sciences, Central South University, China.
 
 
熒光篩選
要找到轉(zhuǎn)基因成功的秀麗 隱桿線蟲 ，需要使用立體顯微鏡進行熒光篩選。
 
線蟲熒光篩選存在一定的挑戰(zhàn)：

• 熒光信號暗淡，難以觀察熒光轉(zhuǎn)基因
• 老線蟲蟲和瓊脂發(fā)出強烈的自發(fā)熒光
• 由于視野較小，難以發(fā)現(xiàn)線蟲，導(dǎo)致篩查時間延長。

使用徠卡顯微鏡可以通過以下方式克服這些篩選難題：

• 采用三光束技術(shù)的獨立激發(fā)通道提高了信噪比，適用于體視顯微鏡
• 使用專門設(shè)計的反射鏡防止自發(fā)熒光，反射鏡可與 Leica 透射光底座一起使用
• 徠卡透射光底座提供大視場和多種對比方法。

 

Thunder image of an adult hermaphroditic C. elegans worm showing the gonads. The worm was stained with the following fluorophores: DAPI (blue) indicating nuclei, SP56 (green) sperm, RME-2 (red) oocytes, and PGL-1 (magenta) RNA and protein granules. Courtesy of C. Eckmann, Martin Luther University, Halle, Germany.
 
   
成像和文件
在篩選和鑒定轉(zhuǎn)基因 秀麗隱桿線蟲 標本后，高分辨率成像和精確記錄對實驗數(shù)據(jù)分析至關(guān)重要。要實現(xiàn)這一目標，需要顯微鏡配備高質(zhì)量的攝像頭或探測器以及兼容的成像軟件。

線蟲成像和記錄方面的主要挑戰(zhàn)是

• 由于光散射的原因，在對線蟲更深處的結(jié)構(gòu)成像時會出現(xiàn)焦外模糊的現(xiàn)象
• 避免光和熱對線蟲造成傷害
• 利用基因編碼報告器觀察活體線蟲的暗淡熒光（包括延時成像）。

使用徠卡顯微鏡可以克服這些挑戰(zhàn)。優(yōu)勢如下

• 利用圖像增強功能，將線蟲深處的細節(jié)可視化
• 使用高質(zhì)量的光學(xué)元件、適當(dāng)?shù)恼彰鞴庠春挽`敏的相機/探測器，減少光照射，降低對線蟲的傷害
• 利用寬場顯微鏡和高靈敏度顯微攝像機的良好單噪比，促進實時成像
• 必要時，使用轉(zhuǎn)盤、共聚焦或光片顯微鏡獲取更高分辨率的三維圖像。

 

Studying the nervous system of C. elegans: Leica confocal microscope images of a roundworm expressing the fluorescent proteins CFP (cyan), GFP (green), YFP (yellow), and DsRed (red).