多基因表達實驗中連接元件2A和IRES的優缺點比較及選擇
在生物學研究中，你是不是經常會碰到這類問題：
1. 想要對表達目的基因的細胞進行示蹤，不知如何將目的基因與熒光蛋白進行連接？
2. 想要用一個載體同時表達多個基因，不知如何將多個基因進行連接？
其實要解決上述問題，通常有這么幾種方法：
● 構建多個表達框，用多個啟動子啟動多個轉錄本轉錄以表達多個基因；
● 在基因之間插入蛋白水解切割位點，利用蛋白水解加工（proteolytic processing）的方法對同一個轉錄本翻譯的融合蛋白進行分離；
● 在基因之間插入內部核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES）；
● 在基因之間插入自剪切多肽2A（self-cleaving 2A peptide，2A）結構。
其中應用最廣泛，最成熟的是采用多順反子表達的方案，也就是我們經常遇見的用IRES和2A元件連接前后兩個基因。
那在具體的實驗設計中，IRES和2A元件要怎么選擇，他們各自有什么優缺點，我們接著往下看。
IRES元件
真核生物的蛋白翻譯主要依賴于mRNA的5’帽子結構。但在真核生物和一些RNA病毒中也存在一些例外情況，如對于缺乏帽子結構的RNA病毒，其蛋白合成起始是依賴于5’端非編碼區的一段特殊的序列，這段非編碼mRNA即IRES。IRES的存在允許核糖體直接結合mRNA起始翻譯。因此，當在兩個基因中間插入IRES元件，上游蛋白依靠5’帽子結構起始翻譯，下游蛋白則依靠IRES起始翻譯。
Fig.1 真核生物mRNA圖示【1】
當前，IRES應用很廣泛，主要是因為IRES上下游的兩個蛋白可以同時表達，并且翻譯出的兩個蛋白是完全獨立的。但是IRES也存在不足的地方，主要涉及如下方面：
1. IRES的序列較長（約600bp），無法像原核SD序列一樣通過引物擴增添加，其應用常受到載體容量的限制；
2. 無法實現IRES前后兩個蛋白的等量表達，IRES的存在有可能會影響mRNA的結構，加上IRES和mRNA的 5’帽子對核糖體/翻譯起始復合物的結合力不同。通常情況下，下游蛋白的表達量僅為上游蛋白的10%~50%。
那么如何能夠實現上下游蛋白的等量表達呢？下面這個元件可以給你幫助。
2A元件
2A肽是Ryan和他的同事在口蹄疫病毒（FMDV）中首次發現的一種“自我切割”的小肽，此外在其它病毒中也發現了2A肽類似序列，其平均長度為18-22個氨基酸，且具有高度保守的C末端序列：-DxExNPGP- 。2A元件會導致核糖體跳過2A肽C末端的甘氨酰（G）— 脯氨酰（P）肽鍵的合成，從而“斷裂”為兩個獨立的蛋白。這個過程被形象地稱為“核糖體跳躍”。
Fig.2 口蹄疫病毒(FMDV)中2A肽的自剪切【2】
2A肽的剪切效率極高，昆蟲病毒和豬捷申病毒中的2A切割效率幾乎是100%，因此使用2A肽作為連接元件，能夠實現多蛋白的等量表達。另外，2A肽長度小，一個典型的序列為EGRGSLLTCGDVEENPG*P（*為切割位點），其DNA序列為54bp，可以通過長引物PCR將其引入基因中的。2A的應用非常廣泛，尤其是連接多個基因的時候，優勢更加明顯。當然也可以將2A及IRES結合使用。查找Addgene現有載體構建數據，對于三基因、四基因之間的連接，連接元件組合使用頻率：2A/2A >2A/IRES> IRES/IRES。
目前已經鑒定出多種2A多肽，其中常用的有4種：F2A（口蹄疫病毒），E2A（馬鼻炎A病毒），P2A（ 豬圓環病毒1），T2A（TaV）。為比較4種2A的切割效率，研究人員將構建的sCMV-NLS-EGFP-2A-mCherry-CAAX質粒分別轉染HEK293T，HT1080，Hela細胞系，斑馬魚胚胎；將sCMV-NLS-EGFP-2A-mCherry-CAAX包裝成腺病毒，對小鼠進行尾靜脈注射，觀察其表達情況。結果發現：無論是在人細胞系，還是在斑馬魚胚胎中，或小鼠組織中，P2A的切割效率均是最高的。這為我們更好地應用的2A結構提供了更明確的證據。
Fig.3 不同2A肽的DNA及相應氨基酸序列，帶下劃線的序列編碼氨基酸GSG，添加GSG可以提高剪切效率【2】
當然2A肽也存在一定缺點，由于斷裂發生在2A多肽C端的甘氨酸（G）和脯氨酸（P）之間，所以，上游蛋白會多出20余個氨基酸的多肽尾巴，下游蛋白會在N端多出一個脯氨酸。這種額外增加的2A肽結構可能會對目的蛋白的功能造成一定的影響。
Fig.4 用2A連接2個基因可以從一個轉錄本生成兩個單獨的多肽【3】
簡而言之，IRES元件可以實現“同時轉錄，獨立翻譯”，2A 肽可以實現“同時轉錄，同時翻譯”，兩者都可以用于多蛋白的同時表達。但由于IRES和2A 肽都有著各自的優缺點，建議參考目的蛋白的相關文獻報道，或依照經驗進行構建。
Reference：
[1] Martinez-Salas E, Francisco-Velilla R, Fernandez-Chamorro J, Embarek AM. Insights into Structural and Mechanistic Features of Viral IRES Elements. Front Microbiol. 2018 Jan 4;8:2629.
[2] Kim JH, Lee SR, Li LH, Park HJ, Park JH, Lee KY, Kim MK, Shin BA, Choi SY. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 2011;6(4):e18556.
[3] Burén S, Ortega-Villasante C, Otvös K, Samuelsson G, Bakó L, Villarejo A. Use of the foot-and-mouth disease virus 2A peptide co-expression system to study intracellular protein trafficking in Arabidopsis. PLoS One. 2012;7(12):e51973.
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