流式抗體染色操作流程（含表面/胞內(nèi)）

流式抗體指可以應用于流式實驗的抗體，與ELISA、WB、IF等實驗抗體相比，通常不需要過于復雜的樣本處理和實驗步驟，同時檢測的是活細胞或者固定細胞，可以獲得單細胞多參數(shù)的定量結(jié)果。流式抗體又分為未標記的和熒光標記的，未標記的流式抗體需要配合相應二抗使用，熒光標記的流式抗體自帶熒光不需要二抗。尚恩生物提供的流式抗體是經(jīng)過熒光標記，可以直接與處理后的樣本進行孵育，然后通過流式細胞儀檢測，若需未標記的流式抗體，可以聯(lián)系銷售人員咨詢。

流式抗體染色流程

一、細胞表面染色操作流程

1、細胞計數(shù)

將培養(yǎng)好的細胞收集于15mL離心管并計數(shù)；若為貼壁細胞，需要先用胰酶消化細胞，300g離心5min，去上清。

2、制備單細胞懸液

將收集的細胞用1mL 預冷0.5%BSA/PBS溶液重懸，300g離心5min，去上清，重復2次；用0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞至濃度1x10⁷個細胞/mL，取100μL細胞懸液置于流式管內(nèi)。

3、（可選）阻斷Fc受體

可用抗體同源血清全IgG抗體與細胞充分混勻，室溫孵育10-20min。

4、一抗孵育

每管加入稀釋后的一抗溶液100μL，2-8℃反應30min，孵育期間每隔10min晃動一下反應管，使細胞和抗體充分反應。若為直標抗體，需要避光反應，跳到步驟7�？贵w稀釋液為0.5%BSA/PBS溶液。

5、洗滌

300g離心5min，去上清后加入200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。

6、二抗孵育

對于非熒光染料直標抗體，加入100μL熒光二抗重懸，避光2-8℃反應30min，孵育期間每隔10min晃動一下反應管。

7、洗滌

300g離心5min，去上清后加入200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。

8、上機分析

用200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞，4℃保存，上機分析。

二、細胞胞內(nèi)染色操作流程

1、細胞計數(shù)

將培養(yǎng)好的細胞收集于15mL離心管并計數(shù)；若為貼壁細胞，需要先用胰酶消化細胞，300g離心5min，去上清。

2、制作單細胞懸液

將收集的細胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，300g離心5min，去上清，重復2次；用0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞至濃度1x10⁷個細胞/mL，取100μL細胞懸液置于流式管內(nèi)，300g離心5min去上清。

3、固定

每管加入100μL細胞固定劑重懸細胞，2-8°孵育20min。固定劑可用4% 多聚甲醛。

4、洗滌

600g離心5min，去上清后加入200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。

5、通透

每管加入100μL細胞通透劑重懸細胞，室溫孵育20min。通透劑可用0.5%BSA/PBS（0.3%TritonX-100）

6、洗滌

600g離心5min，去上清后加入200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。

7、（可選）阻斷Fc受體

用抗體同源血清全IgG抗體與細胞充分混勻，室溫10-20min。

8、一抗孵育

每管加入稀釋后的一抗溶液100μL，2-8℃反應30min，孵育期間每隔10min晃動一下反應管，使細胞和抗體充分反應。若為直標抗體，需要避光反應，跳到步驟11�？贵w稀釋液為0.5%BSA/PBS溶液。

9、洗滌

600g離心5min，去上清后加入200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。

10、二抗孵育

對于非熒光染料直標抗體，加入100μL熒光二抗重懸，避光2-8℃反應30min，孵育期間每隔10min晃動一下反應管。對于直標抗體直接跳到步驟11。

11、洗滌

600g離心5min，去上清后加入200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸，離心去上清，重復兩遍。

12、上機分析

用200μL 0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞，4℃保存，上機分析。

注：

實驗建議設置空白對照，同型對照，空白對照不加一抗，同型對照將一抗替換為同型抗體。