顯微課堂：Drosophila（果蠅）研究顯微鏡使用指南

提高果蠅工作步驟的效率，促進與發育生物學、遺傳學和神經科學有關的研究。

一個多世紀以來，果蠅（典型的黑腹果蠅）一直被用作模式生物。原因之一是果蠅與人類共享許多與疾病相關的基因。果蠅經常被用于發育生物學、遺傳學和神經科學的研究。果蠅的優點包括易于飼養且成本低廉、繁殖速度快、基因組完全測序以及可獲得各種基因品系。使用徠卡顯微鏡可以進行高效的果蠅研究。

使用黑腹蠅蛆的常規實驗室方法包括：

1. 向胚胎顯微注射DNA進行基因改造（轉基因）。

2. 通過觀察解剖特征對果蠅進行基本分類的 "揀蠅法"。

3. 熒光篩選，例如觀察胚胎或幼蟲，找出成功轉染熒光蛋白的胚胎或幼蟲。

4. 用于研究大腦或其他解剖結構的解剖案例。

5. 在實驗過程中對篩選出的果蠅（活體和固定的）或解剖結構進行成像和記錄。

這些步驟通常使用體視顯微鏡、復合顯微鏡或共聚焦顯微鏡進行。

果蠅的轉基因通常是通過向果蠅胚胎顯微注射DNA來完成的。進行顯微注射需要顯微鏡。

胚胎顯微注射面臨著一些挑戰：

1. 顯微鏡物鏡下有足夠的空間放置微型注射器。

2. 視野小限制了同時觀察胚胎的數量。

3. 傷害胚胎的風險。

4. 在進行注射時保持舒適，因為注射需要重復動作，可能需要幾個小時。

使用徠卡體視顯微鏡可以克服這些挑戰，該顯微鏡為用戶提供以下功能：

1. 視野大，可同時看到多個胚胎。

2. 配件使顯微鏡更符合人體工程學，最大限度地減少用戶的疲勞和勞損。

3. 與市面上的顯微操作設備兼容。
   
   圖 2：示意圖展示了將DNA微量注射到果蠅胚胎中的過程。

根據特定的表型或解剖特征對果蠅進行分類，即所謂的 "揀蠅"，必須在顯微鏡下進行。

與揀蠅相關的挑戰有：

1. 一些細節可能難以觀察到。

2. 小視場限制了同時觀察到的果蠅數量。

3. 既要有足夠高的放大倍率來觀察解剖細節，又要有足夠大的景深來將果蠅按（分類）到不同的組中。

4. 用于麻醉果蠅的CO2（二氧化碳）墊對底座來說太大，存在風險。

然而，使用徠卡體視顯微鏡可以克服這些挑戰。用戶可以獲得以下好處：

1. FusionOptics技術可同時實現更高的分辨率和更大的景深。

2. 更舒適的設置，減少疲勞和勞損，采用人體工程學模塊。

3. 使用中等大小的底座或搖臂支架，為二氧化碳墊留出足夠的空間。

圖 3：使用徠卡體視顯微鏡進行果蠅分揀操作。通過二氧化碳（CO₂）管對果蠅進行麻醉（1），并在分揀過程中使用帶有 CO₂ 的果蠅操作墊維持麻醉狀態（2）。樣品由奧地利維也納大學神經生物學系的T. Hummel 提供。

要找到成功轉染熒光蛋白的果蠅胚胎或幼蟲，就必須對其進行熒光篩選。這項工作使用熒光體視顯微鏡進行。

對胚胎或幼蟲進行熒光篩選有一定的難度：

1. 信噪比（SNR）過低導致分辨率不足，從而難以分辨不同表型的細微差別。

2. 通常情況下，分辨率和景深之間存在折衷關系。

3. 果蠅及其食物發出的自發熒光。

4. 長時間使用顯微鏡時保持舒適。

使用徠卡體視顯微鏡可以克服這些篩選難題。它可以幫助用戶完成以下工作：

1. 利用TripleBeam技術降低熒光背景噪聲，提高信噪比。

2. 得益于FusionOptics技術，可同時獲得高分辨率和大景深效果。

3. 利用計算清除功能，即使是胚胎或幼蟲深處的細節也能清晰地顯示出來。

4. 多種對比方法和專門設計的反射鏡，配備Leica透射光底座，可減少自發熒光。

5. 使用人體工程學模塊，用戶可以舒適地工作，減少疲勞和勞累。

編輯搜圖 4：使用THUNDER顯微鏡拍攝并經過LVCC（大體積計算清除）處理的黑腹果蠅卵泡。綠色區域為aPKC染色，洋紅色區域為Dlg染色。樣品由美國加利福尼亞大學伯克利分校的M. Khoury和D. Bilder提供。

解剖果蠅是在必須研究大腦或其他解剖結構時進行的。這也需要顯微鏡。

果蠅解剖面臨的挑戰有：

1. 標本小而易碎，因此很難看到內部結構。

2. 在大腦解剖過程中，應避免與空氣接觸。

3. 實現速度和精度都很困難。

4. 在溶液中解剖果蠅時的反光。

使用徠卡體視顯微鏡可以克服解剖難題。用戶可以利用以下優勢：

1. 利用體視顯微鏡輕松確定蠅類標本的三維方向。

2. 采用人體工程學模塊，工作舒適，減少疲勞和勞累。

3. 使用偏振鏡和各種照明選項可以大大減少溶液表面的反射。

編輯搜圖圖 5：使用M125體視顯微鏡解剖的三只果蠅大腦圖像。果蠅大腦表達紅色熒光蛋白（RFP）。圖像由徠卡熒光體視顯微鏡拍攝。大腦的取向如圖所示，以便后續共聚焦成像。樣品由奧地利維也納大學神經生物學系的L. Geid和T. Hummel提供。

在對果蠅進行篩選和可能的解剖之后，往往需要對實驗進行成像和記錄。這一步需要一臺帶有攝像頭和軟件的顯微鏡。

果蠅實驗成像和記錄方面的主要挑戰是：

1. 避免蠅類標本因光和熱的照射而受損，尤其是在實時成像過程中。

2. 標本移出視野。

3. 由于光散射的原因，在對厚結構或標本深處的結構成像時，會出現焦外模糊的情況。

4. 獲取3D標本的對焦2D圖像。

徠卡顯微鏡可以克服這些挑戰。以下是其優勢：

1. 使用高幀頻、高靈敏度的顯微鏡相機記錄快速事件。

2. 借助計算清除功能，快速查看果蠅標本深處的細節。

3. 使用寬場顯微鏡對果蠅標本進行更柔和的光照射。

4. 利用擴展景深 (EDOF) 成像技術獲取整個Z疊的同焦圖像。

5. 利用光片和共聚焦顯微鏡獲得更高分辨率的果蠅標本圖像。

編輯圖 6：果蠅胚胎神經元中鈣瞬變的時間序列成像，每幅圖像（A–F）代表約10.5秒的平均時間間隔。圖像使用THUNDER成像儀和計算清除技術獲取。樣品由美國加利福尼亞州Clandinin實驗室的A. Carreira-Rosario提供

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