凝膠過濾層析選擇三步法及實驗優化小技巧
凝膠過濾層析是一種基于樣品和雜質分子大小差異實現分離純化的經典而高效的層析技術。雖然凝膠過濾層析分辨率較高，面對難以分離的雜質經過適當的優化往往可以達到更高的純度。接下來，小優就帶大家看看有哪些優化的小技巧吧。
1、凝膠過濾層析選擇三步法
想要達到盡可能高的分辨率，選擇合適的產品非常重要。凝膠過濾層析的選擇可以按照三步策略：選擇合適的分離范圍，使用合適的上樣量，以及盡可能選擇粒徑較小的層析柱。
（1）選擇合適的分離范圍
在購買層析柱或者選擇實驗室已有的層析柱時，首先應關注層析柱適合的分離范圍。例如下圖所示，不同的層析柱適合的蛋白分離范圍也有差別，表明層析柱在這個分子量范圍內具有最佳的分離效果。目標蛋白的分子量應在層析柱的分離范圍內，如果多個層析柱分離范圍有重疊，則目標蛋白的分子量在分離范圍靠近中間較好。
Superdex™ 預裝柱高分辨率優選半制備純化
| 產品代碼 | 產品 | 內徑x床高(mm) | 柱體積(mL) | 平均顆粒(ym) | 球蛋白分離范圍(Da) | 應用/特性 | 耐壓(MPa) | 最高流速(mL/min) |
| 29219757 | Superdex™ 30 Increase 10/300 GL | 10/300 | 24 | 9.0 | 100-7,000 | 肽及其他小分子的半制備和高性能分析純化 | 3.0 | 1.2 |
| 29148721 | Superdex™ 75 Increase 10/300 GL | 10/300 | 24 | 3,000-70,000 | 蛋白、肽、核甘酸及其它小分子的半制備和高性能分析純化 | 1.6 | ||
| 29148722 | Superdex™75 Increase 5/150 GL | 5/150 | 3 | 3,000-70,000 | 0.75 | |||
| 28990944 | Superdex™ 200 increase 10/300 GL | 10/300 | 24 | 8.6 | 10,000-600,000 | 蛋白、DNA 片段及其它小分子的半制備和高性能分析純化 | 1.8 | |
| 28990945 | Superdex™ 200 Increase 5/150 GL | 5/150 | 3 | 10,000-600,000 | 0.75 |
（2）使用的合適的上樣量
凝膠過濾層析對上樣量有限制，根據實驗目的的不同，Cytiva也為客戶提供多種不同規格的層析柱。普通的10/300的柱型，柱體積是24ml，上樣量最大為500ul；3.2/300和5/150柱型則適合于更小的上樣量；如果上樣量較大，也可以選擇120ml和320ml的Hiload柱型，最大可上樣13ml。
（3）盡可能選擇粒徑較小的層析柱
在購買和選擇層析柱時，每個層析柱都會標明里面填充的凝膠小球的粒徑。粒徑較大的凝膠小球流速快，反壓小，但通常分辨率不高。如果想要達到較高的純度，應盡可能選擇粒徑較小的層析柱。如下圖，Superdex Increase系列粒徑為9um，是高分辨率的優選。
Superdex™ 預裝柱高分辨率優選半制備純化
| 產品代碼 | 產品 | 內徑x床高(mm) | 柱體積(mL) | 平均顆粒(ym) | 球蛋白分離范圍(Da) | 應用/特性 | 耐壓(MPa) | 最高流速(mL/min) |
| 29219757 | Superdex™ 30 Increase 10/300 GL | 10/300 | 24 | 9.0 | 100-7,000 | 肽及其他小分子的半制備和高性能分析純化 | 3.0 | 1.2 |
| 29148721 | Superdex™ 75 Increase 10/300 GL | 10/300 | 24 | 3,000-70,000 | 蛋白、肽、核甘酸及其它小分子的半制備和高性能分析純化 | 1.6 | ||
| 29148722 | Superdex™75 Increase 5/150 GL | 5/150 | 3 | 3,000-70,000 | 0.75 | |||
| 28990944 | Superdex™ 200 increase 10/300 GL | 10/300 | 24 | 8.6 | 10,000-600,000 | 蛋白、DNA 片段及其它小分子的半制備和高性能分析純化 | 1.8 | |
| 28990945 | Superdex™ 200 Increase 5/150 GL | 5/150 | 3 | 10,000-600,000 | 0.75 |
2、凝膠過濾層析二倍原則
凝膠過濾層析當目標蛋白和雜蛋白分子量相差1倍以上時，可以得到較高的分離效果。如果目標蛋白和雜蛋白分子量相差不大，也可以考慮使用離子交換等其他層析技術進行分離。
3、柱高的優化
凝膠過濾層析在分離時需要有較長的路徑，因此柱高越長，分離效果會越好。一般柱高增加一倍，分辨率可以提高約40%。因此，如果是出于分離目標蛋白和雜蛋白的目的，應選擇較長的10/300的柱子，5/150的柱子更適合于做快速篩選。
如果選擇空柱自己填裝，也應在確定柱體積的情況下，盡可能選擇直徑較小，柱高較長的“細長型”的柱子，可以達到更高的分辨率。
如果實驗室沒有較長的層析柱，也可以選擇將兩個層析柱串聯使用，以提高純度。
4、運行流速的優化
在不改變層析柱的情況下，如果想盡可能提高純度，可以適當降低流速。有數據表明，降低運行流速有利于提高分辨率，但也會增加時間成本。初次實驗可以參考說明書上的推薦流速進行。此外，如果樣品粘度較高，或者在低溫時運行實驗時，應適當降低流速。
5、樣品上樣體積的優化
在不改變層析柱的情況下，如果想盡可能提高純度，可以適當減少上樣體積。有數據表明，較少上樣體積有利于提高分辨率，凝膠過濾層析柱的上樣量通常建議為層析柱柱體積的2%-5%，如果樣品量較大，可以使用超濾管進行樣品濃縮后再上樣。
6、填料裝填效果的優化
層析柱中填料的裝填效果對分辨率也會產生較大的影響。Cytiva的預裝柱在出廠前已經進行了柱效測定，具有嚴格的出廠柱效標準。如果是自己填裝的層析柱，通過直接觀察很難觀察出填料裝填的好壞，因此需要進行柱效測定。填料排列不整齊，或者填料大小不均一，或者填料有破碎，都會極大的損害到分離效果。柱效檢測的方法可以參考操作視頻：https://www.univ-bio.com/article/id-7650.html。如果柱效不佳，可以考慮重新填裝柱子，并且在購買填料時，應盡可能選擇粒徑均一，沒有破碎的優質填料。
層析柱經過一段時間的使用，如果發生堵塞，超壓等不良使用的情況，也可能造成柱效降低，此時也可以通過柱效檢測的方法重新進行柱效檢測。
部分凝膠過濾層析熱賣產品
部分熱賣針式過濾器
| 貨號 | 品名 | 規格 |
| 29148721 | Superdex 75 Increase 10/300 GL | 10 x 300 mm |
| 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL | 10 x 300 mm |
| 29219757 | Superdex 30 Increase 10/300 GL | 10 x 300 mm |
| 28990945 | Superdex 200 Increase 5/150 GL | 5 x 150 mm |
| 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL | 10 x 300 mm |
| 29091598 | Superose 6 Increase 3.2/300 | 3.2 x 300 mm |
| 28989333 | HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | 16 x 600 mm |
| 28989335 | HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | 26 x 600 mm |
| 28989334 | HiLoad 26/600 Superdex 75 pg | 26 x 600 mm |
| 28989336 | HiLoad 26/600 Superdex 200 pg | 26 x 600 mm |
| 17104401 | superdex 75 pg | 150ml |
| 17104301 | superdex 200 pg | 150ml |
| 17059901 | Sephacryl S-300 HR | 750ml |
| 17058410 | Sephacryl S-200 HR | 150ml |
部分熱賣針式過濾器
| 貨號 | 名稱 | 濾膜材質 | 孔徑 | 規格 |
| abs7294-1盒 | 33mm針式過濾器 | PES | 0.2um | 50個 |
| abs7295-1盒 | 33mm針式過濾器 | PES | 0.45um | 50個 |
| abs7294-1箱 | 33mm針式過濾器 | PES | 0.2um | 500個 |
| abs7295-1箱 | 33mm針式過濾器 | PES | 0.45um | 500個 |
| abs7290-1盒 | 33mm針式過濾器 | PVDF | 0.2um | 50個 |
| abs7291-1盒 | 33mm針式過濾器 | PVDF | 0.45um | 50個 |
| abs7290-1箱 | 33mm針式過濾器 | PVDF | 0.2um | 500個 |
| abs7291-1箱 | 33mm針式過濾器 | PVDF | 0.45um | 500個 |
標簽：
凝膠過濾層析
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