神經類和血管類Cre漏表達的區別及應對策略的深入探討

在利用Cre-loxP系統進行細胞特異性基因操作的研究中，每一個研究者最怕的可能就是在非目標組織中發現Cre活性漏表達。一旦遇到這種情況，第一個反應往往是：我這批小鼠還能用嗎？實驗數據是不是都廢了？

答案是：不要慌！漏表達并不等同于不可用。許多廣泛使用、并被領域公認的Cre品系本身也存在不同程度的泄漏。關鍵在于正確理解泄漏的來源、評估其對實驗的具體影響，并通過嚴謹的基因型鑒定來規避誤讀。本文將深入探討神經類和血管類Cre漏表達的區別及應對策略。

01 神經類Cre鼠生殖泄漏
神經科學研究中常用的Cre品系，如Nestin-Cre，Emx1-Cre或Camk2a-Cre，通常被認為具有較高的神經元特異性^[1]。然而，大量研究證實，神經類Cre鼠和flox鼠交配，可能出現大量生殖泄漏的情況，當Cre在生殖細胞（精子或卵子） 中發生泄漏表達時，會導致flox區域在配子形成過程中就被刪除，從而直接傳遞給后代。

你本以為后代基因型是“Cre陰性; flox陽性”的對照組小鼠，實際上其全身所有細胞可能都已經是“雜合或純合敲除”型了，因為它們從受精卵開始就繼承了已被刪除的等位基因。但因為這些品系的核心驅動效率足夠強，在目標細胞群中能實現高效、特異的基因重組。所以仍然被廣泛認可和使用。

如何應對？
遇到生殖泄漏嚴重的Cre鼠，與flox鼠交配后，要盡早對子代鼠嚴格進行雙品系基因型的鑒定和篩選。

雙陽性鼠的鑒定，包括對Cre和flox基因型的鑒定，flox基因型需要同時確認flox是否敲入，以及KO條帶的有無。如果子代出現Cre陰性，flox陰性，KO陽性的基因型，說明親本Cre鼠已經出現嚴重的生殖泄漏，需要及時剔除這樣的親本和子代小鼠；同時也要剔除Cre陽性，flox陰性，有KO條帶的子代鼠，避免生殖泄漏范圍進一步擴大。這樣通過對后代進行嚴格的基因型鑒定，以確保敲除是組織特異性的而非全身性的。

02 血管類Cre泄漏：基因型檢測的陷阱
常用的血管內皮細胞Cre品系，如 Tie2-Cre 和Cdh5-Cre，都有一個特點^[2]：在通過鼠尾或腳趾進行基因型鑒定時，你很可能在幾乎所有組織（包括血液細胞）的DNA樣本中都能檢測到Cre介導的重組信號，即flox+KO嵌合；Cre陽性的基因型。

為什么會這樣？
這是因為這些基因的啟動子在胚胎發育早期（如在造血干細胞中）就有短暫但廣泛的活性。這些早期表達Cre的細胞及其后代（包括各種血細胞）會永久地攜帶重組的基因，因此從這些細胞中提取的DNA會永遠呈現陽性信號。這通常不影響體內實驗， 在成年小鼠的體內，這些Cre的表達通常會被限制在血管內皮細胞中，具有很高的特異性。

如何應對與驗證？
基因型PCR檢測的是“DNA是否被重組過”，而不是“Cre現在是否在表達”。陽性信號只代表動物體內存在一些發生過重組的細胞，并不代表你的目標組織（如心臟、大腦的血管）被特異性敲除了。

如果擔心Cre有漏表達現象，可先通過基因型鑒定，篩選出flox+KO嵌合；Cre陽性的基因型。再通過免疫組化（IHC） 或免疫熒光（IF），在組織切片水平直接觀察你的目標基因蛋白是否在血管內皮細胞中被成功敲除，同時在其他細胞類型（如周圍的平滑肌細胞、神經元、血細胞）中是否仍然存在^[3]。這是證明其體內特異性的最直接證據。

血管類Cre鼠的泄漏信號是發育的痕跡，不代表成年期特異性喪失。只要通過組織學驗證其在體內的內皮特異性，它們就完全可以正常使用。

如果遇到構建好的Cre鼠出現嚴重生殖泄漏，完全篩選不出特異性的后代，此時可優先選擇用誘導型CreER鼠代替Cre鼠，該小鼠只有在給予他莫昔芬（Tamoxifen）后，CreER才會進入細胞核發揮作用，這可以極大地控制重組發生的時間，并有效避免發育早期或生殖系中的泄漏表達。

圖1. Tamoxifen誘導的Cre-ER系統原理^[4]

總之，沒有完美的Cre，幾乎所有Cre品系都存在某種程度的泄漏，這是由啟動子特性、插入位點、表觀遺傳等多種因素決定的。

遇到Cre漏表達，首先要做的是科學的診斷，而不是恐慌性的廢棄。理解泄漏的性質，設計合理的鑒定和篩選方法，你的實驗依然可以產出可信的數據。

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參考文獻：
[1] Madison, L., et al. (2015). A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nature Neuroscience, 18(6), 793–802.

[2] Alva, J. A., et al. (2006). VE-Cadherin-Cre-recombinase transgenic mouse: a tool for lineage analysis and gene deletion in endothelial cells. Developmental Dynamics, 235(3), 759–767.

[3] Tang, S., et al. (2010). A Cre recombination-based reporter system for mapping and manipulating neural circuits. Nature Protocols, 5(6), 1086–1100. 

[4] Kim H, Kim M, Im SK, Fang S.Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles oftarget genes. Lab Anim Res. 2018;34(4):147‐159. doi:10.5625/lar.2018.34.4.147.

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