Pld4-KO小鼠助力證實人類PLD4缺陷可導致SLE并闡明其致病機制
2025年9月10日，由良渚實驗室、東部戰區總醫院國家腎臟疾病臨床醫學研究中心和浙江大學生命科學研究院等單位合作完成的題為“Loss-of-function mutations in PLD4 lead to systemic lupus erythematosus”的研究論文在《Nature》發表。該研究首次證實人類PLD4缺陷可導致SLE并闡明了其致病機制，為SLE的精準診療提供了重要理論依據。
南模生物為該研究提供了Pld4-KO（目錄號：NM-KO-200682）小鼠。
系統性紅斑狼瘡（SLE）是一種臨床表現異質性高、多系統受累的自身免疫性疾病，患者常伴有特異性自身抗體陽性及補體激活。SLE確切發病機制尚未完全明確，遺傳因素與免疫異常在其發生發展中起關鍵作用。單基因狼瘡是自身免疫性疾病的一個亞型，由單基因突變引起，包含一系列具有狼瘡樣表型的疾病，目前已發現SLE的致病基因有30余個。
細胞內核酸感知通路在抵御外來病原體、修復組織損傷中發揮關鍵作用。定位于內體中的Toll樣受體7（TLR7）和9（TLR9）是感知RNA和DNA的核心分子，對系統性紅斑狼瘡的發病至關重要。在漿細胞樣樹突狀細胞（pDCs）中，TLR7和TLR9通路的激活會促使細胞釋放大量干擾素，進而促進自身抗原提呈和炎癥反應發生；在B細胞中，這兩條通路的激活則會誘導細胞產生大量抗核酸自身抗體，推動系統性紅斑狼瘡的發展。
磷脂酶D家族成員4（phospholipase D family member 4，PLD4）在樹突狀細胞、單核細胞和B細胞中高表達。其作為一種定位于內溶酶體的5’核酸外切酶，能切割單鏈RNA（ssRNA）和單鏈DNA（ssDNA），進而限制TLR7和TLR9的過度激活。
已有研究表明，Pld4基因敲除小鼠會出現一系列自身免疫表型，包括體重減輕、脾臟腫大、自身抗體增加和免疫復合物沉積。此外，同時缺失Pld4及其家族成員Pld3的小鼠會在幼年期死亡。盡管Pld4缺陷小鼠會出現自身免疫表型，但PLD4基因突變導致的人類疾病尚未見報道。
圖1. Pld4突變小鼠表現出顯著的脾腫大、淋巴結病變及體重降低（Ann Rheum Dis. 2019;78(4):509-518）
那人類中PLD4是否致病SLE？具體機制是什么？以及是否具有靶向治療意義？
為明確這些問題，研究人員進行了以下研究：
在SLE患者中發現PLD4變異
五名患者均確診為系統性紅斑狼瘡（SLE），且全部表現為腎臟受累，腎活檢提示增殖性狼瘡腎炎（圖1a）。所有患者均出現白細胞減少、貧血和血小板減少等血液系統異常。其中四人出現皮疹（如蕁麻疹、顴部紅斑或斑片狀皮疹），三人有關節痛/關節炎及漿膜炎（附表1）。所有患者抗核抗體（ANA）均為陽性并伴有低補體血癥。全外顯子組測序結果表明，所有患者均攜帶PLD4基因的雙等位基因突變（圖1b）。這些突變均位于PLD4的催化結構域內，并被預測為有害變異（圖1c）。雖然這些突變在空間上并不聚集于單一結構域，但結構預測表明它們可能通過影響氫鍵形成或底物結合等不同機制，進而損害外切酶活性。
圖2. 5名SLE患者雙等位基因PLD4變異的鑒定
PLD4突變顯著激活DCs細胞功能
為全面評估患者的炎癥水平，研究團隊對患者P1、P2及健康對照的外周血單核細胞（PBMCs）進行了RNA-seq。GSEA分析顯示，IFNα反應、IFNγ反應以及通過NF-κB介導的TNF信號通路是最顯著富集的通路（圖2a）。熱圖及流式細胞術結果表明，I型干擾素通路相關基因及STAT1磷酸化水平均顯著上調（圖2b, 2c）。
進一步單細胞RNA測序（scRNA-seq）揭示，I型干擾素通路相關基因（如IFIT2、OAS2等）的高表達主要集中在表達PLD4的樹突狀細胞（DCs）和單核細胞中；同時，這些細胞中TLR7/9及其信號分子（TRAF6、IRAK1、IRAK4）的表達也顯著升高（圖2d-f）。質譜流式檢測技術（CyTOF）結果表明，患者P2的外周血單核細胞（PBMCs）中IFNα、IFNγ、TNF、IL-1β、CXCL2、CCL4、IL-23和GM-CSF水平顯著升高，其中DCs的指標尤為突出（圖2g）。以上結果提示PLD4缺陷可能通過影響DCs細胞功能引發患者系統性炎癥和自身免疫反應。
圖3. 患者DC中TLR 信號傳導和I型干擾素通路的異常激活
PLD4基因突變激活關鍵免疫炎癥信號通路
為明確上述突變對PLD4功能的影響，研究團隊利用純化的野生型和PLD4突變蛋白來評估其單鏈核酸外切酶活性。結果表明，這些錯義突變（Pro181Leu、Asp189Glu、Arg201Gln、Tyr248Cys、Ala323Val和Gly457Asp）會顯著降低PLD4的外切酶活性（圖3a）。通過在HEK293T過表達突變PLD4后進行核酸外切酶活性檢測，結果與上述一致，所有突變型PLD4組中的單鏈DNA均未被切割（圖3b）。此外，研究團隊也對患者P1和健康對照組外周血單核細胞（PBMCs）中內源性PLD4的核酸外切酶活性進行了評估。結果顯示，在進行核酸外切酶活性檢測的1、2和4小時后，患者P1的殘留底物量隨時間推移持續增加，這表明患者P1體內內源性PLD4的核酸外切酶活性存在缺陷（圖3c)。
對患者P1和P2的PBMCs進行RNA測序分析，結果顯示，無論是基礎水平還是CpG-DNA刺激后，與健康對照組相比，患者體內I型干擾素通路基因表達水平均顯著升高（圖3d)。（知識小課堂：CpG-DNA是一類以CpG二核苷酸為核心的未甲基化的特殊DNA序列，可以激活免疫活性細胞產生多種細胞因子。CpG-DNA能通過TLR9直接活化 B 細胞，誘導其增殖并抑制其凋亡。此外，CpG-DNA還能促進免疫球蛋白和IL-6、IL-10 和 IL-12等多種細胞因子的分泌，增加MHC II類分子和B7共刺激分子的表達，激活單核巨噬細胞及樹突狀細胞分泌Th1型細胞因子和趨化因子，從而促進淋巴細胞增殖和誘發體液及細胞介導的免疫反應）。qPCR結果證實，TNF、IFNA2、IFIT1、ISG15和RSAD2等關鍵炎癥基因的轉錄水平在患者PBMCs中也呈現上調趨勢，且這種上調現象在基礎狀態和CpG-DNA刺激后均與健康對照組存在差異。而未攜帶PLD4突變的SLE患者經CpG-DNA刺激后的PBMCs僅表現出微弱反應（圖3e)。在PLD4-KO THP-1細胞中進行檢測，結果表明，經CpG-DNA刺激后，與野生型細胞相比，PLD4-KO細胞中IFIT1、IFI44L和CXCL3的表達量增顯著加（圖3f)。以上結果提示，研究結果表明TLR7/9通路是PLD4功能缺失調控的關鍵信號通路。
圖4. 突變對PLD4核酸外切酶活性的影響
既往研究表明，在Pld3-/-；Pld4-/-雙敲除小鼠中STING依賴性信號傳導被激活，同時PLD3基因敲除會導致線粒體DNA在溶酶體中異常積聚并發生胞質泄漏，從而激活cGAS-STING信號通路并引發自噬反應。因此，研究團隊進一步探究了STING通路在PLD4缺陷驅動的炎癥中的作用。Western blot結果表明，PLD4-KO THP-1細胞系中STING的磷酸化和炎癥途徑增強；使用STING特異性抑制劑H-15126處理后，可有效抑制PLD4缺失引發的I型干擾素信號通路激活（圖3g)。同時，經H-151（STING 抑制劑）和C-17626（STING 抑制劑）處理后，下游炎癥相關基因（尤其是I型干擾素相關基因，如IFIT1、IFI27、IFI44、OAS1和ISG15）顯著下調（圖3h)。以上結果提示，STING通路是PLD4功能缺失調控的另一關鍵信號通路。
Pld4-KO小鼠表現出人類SLE病理特點
為揭示PLD4基因功能缺失性突變導致SLE的致病機制及其主要效應免疫細胞群，研究團隊構建了Pld4基因敲除小鼠（Pld4-KO）模型。結果顯示，Pld4-KO小鼠表現出典型的狼瘡樣表型，包括體重減輕、脾腫大、自身抗體升高及腎臟免疫復合物等（圖4a、4b）。進一步對腎臟進行scRNA-seq，結果顯示，相較于野生型小鼠，Pld4-KO參與I型IFN通路的基因，如Ifi27、Isg15和Ddx58，在Pld4的免疫細胞和腎組織細胞（足細胞、內皮細胞、主細胞和近端腎小管細胞）中均顯著上調（圖4c）。流式細胞術分析進一步證實了scRNA-seq分析結果：相較于野生型小鼠，Pld4-KO小鼠的免疫細胞群呈現顯著擴增（圖4d）。在SLE發病機制中起關鍵作用的細胞群，包括漿細胞樣樹突狀細胞（pDCs）和漿細胞（PCs），均顯著增加（圖4e、4f）。此外，CD4+ T細胞和CD8+ T細胞數量顯著上升，而年齡相關的B細胞及髓系樹突狀細胞（mDCs）則保持穩定（圖4g）。
最后，研究團隊構建了混合骨髓嵌合體小鼠模型（將來自WT-CD45.1-WT-CD45.2或WT-CD45.1-Pld4-KO-CD45.2 的骨髓按1:1比例混合，移植入經致死劑量輻照的CD45.1小鼠體內），證實pDCs和PCs的異常擴增是PLD4基因缺陷的細胞內在作用，從而闡明了PLD4在維持免疫穩態中的關鍵作用（圖4h、4i）。以上結果提示，PLD4在SLE的發生發展中發揮關鍵作用，并通過調控炎癥反應影響腎炎的病理進程。
圖5. Pld4-KO小鼠出現自身免疫表型
延伸閱讀：CD45.1/CD45.2、Thy1.1/Thy1.2、OT-1/OT-2小鼠，應該pick誰？
JAKi可挽救Pld4-KO小鼠表型
鑒于I型干擾素通路在Pld4-KO小鼠和患者體內均顯著上調，研究團隊推測使用JAK抑制劑（JAKi）巴瑞替尼（baricitinib，已獲批用于SLE疾病的治療）治療可能具有一定療效。為驗證這一猜想，研究團隊通過對Pld4-KO小鼠進行干預驗證，持續灌胃給藥8周后，與未治療組相比，巴瑞替尼治療組小鼠在體重增加、抗雙鏈DNA抗體和抗雙鏈RNA抗體血漿水平、脾臟體積等方面均得到顯著改善（圖5a-c）。隨后，研究團隊對患者來源的PBMCs進行了巴瑞替尼治療。結果顯示，該藥物顯著抑制了患者PBMC中異常升高的I型IFN通路，并對NF-κB通路產生部分抑制效應（圖5f)。綜上所述，I型干擾素通路是PLD4缺陷后自身免疫和炎癥表型的關鍵調控通路。
圖6. 巴瑞替尼逆轉Pld4-KO小鼠的異常表型
總的來說，本研究在5名SLE患者中鑒定出PLD4雙等位基因功能喪失突變，首次確立“PLD4缺乏病（PLDD）”這一單基因SLE亞型；功能實驗證實PLD4缺失通過擾亂內體核酸穩態、過度激活Ⅰ型IFN通路致病。小鼠與患者樣本均顯示JAK抑制劑baricitinib可顯著逆轉異常表型，為PLDD提供精準靶向治療策略。綜上，該研究不僅拓展了對SLE遺傳背景的理解，明確了PLD4在發病中的核心作用，也為未來開展基于基因分型的個體化治療提供了重要依據。
圖7. 研究模式圖
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