離子通道蛋白WB實驗的技巧及注意事項
引言
2021年的諾獎頒發給了戴維·朱利葉斯和阿登·帕塔普蒂安,以表彰他們在“發現溫度和觸覺感受器”方面作出的貢獻，主要是新的離子通道蛋白TRPV1和Piezo。之前的文章，小優跟大家一起回顧了兩位大佬的發現之旅。其實，這是離子通道領域第三個諾獎。1991年，埃爾溫·內爾以及伯特·薩克曼由于發明膜片箝電位記錄技術，證實離子通道獲獎。2003年，頒發給了發現水通道的彼得·阿格雷和利用X射線晶體成像技術展現離子通道結構的羅德里克·麥金農。
離子通道蛋白的研究方法
針對離子通道的研究逐漸涉及許多科學技術，例如電生理學，免疫學，基因工程和影像學等。隨著研究體系的發展，目前形成通過基因工程選擇特定基因，構建文庫，過表達或者敲除等方式進行篩選; 通過膜片鉗技術觀察電位變化；免疫學和影像學進行后續的蛋白結構、位置、表達水平的鑒定。其中免疫學中最常見的實驗方法是免疫印跡(WB)，但我們發現在用WB研究離子通道蛋白的過程中，經常結果不盡人意。鑒于離子通道蛋白的特性，要想WB一次成功，小優細節君整理了如下Tips，希望能夠幫到您。
02 離子通道蛋白WB實驗的注意事項
2.1 樣品類型與蛋白特征
樣品制備是任何蛋白質印跡 (WB) 中至關重要的第一步。您使用的制備方案取決于您計劃使用的樣品類型和蛋白特征。
對于細胞（貼壁/懸浮）樣品，建議直接用Laemmli樣品緩沖液,該方法將幾乎所有細胞蛋白質釋放到緩沖液中。如果后續要做IP，應該使用溫和去垢劑（Triton X-100或者NP-40）制備細胞系。對于組織樣品，例如，從心臟、腦組織和脂肪組織中提取相同蛋白質的最佳方法不一定是相同的。通常，可以同時嘗試兩種裂解方案，比如“富集膜蛋白”或“常規制備”，最后選擇對目的蛋白最合適的方案。
此外，還需要考慮蛋白質的亞細胞定位（例如，質膜蛋白和核蛋白需要不同的樣品制備方法），以及目標蛋白是否富含脂筏等特定微結構域(低溫下脂筏能抵抗非離子去垢劑的抽提，超聲有助于裂解過程)。當目的蛋白豐度很低時，還需要濃縮膜組分。蛋白具有多重跨膜結構域時，需要注意防止蛋白聚集或降解。
2.2 裂解液與裂解方式
對組織或細胞樣品進行裂解是為了釋放目的蛋白、不同裂解緩沖液對蛋白溶解能力各不相同。現在裂解液市面上有很多，有RIPA，NP-40，Triton X-100，SDS等，那我們如何去做選擇呢？
離子通道抗體廠家Alomone不建議使用RIPA進行裂解樣品，RIPA往往會“破壞”膜蛋白，導致膜蛋白降解，特別不適合多重跨膜蛋白和易降解膜蛋白。另外，RIPA 裂解液提取蛋白已被證實有10-30%的蛋白會丟失在不可溶組分中。Laemmli樣品緩沖液釋放更加全面。有些蛋白對于降解非常敏感，可以嘗試不同的樣品裂解液。
在裂解組織蛋白時，請注意全程需在冰上操作，裂解時需加入cocktail形式的蛋白酶體抑制劑。對于核蛋白和富含脂筏的，裂解時強烈建議超聲處理，可以更大程度釋放蛋白。組織勻漿時，避免使用勻漿珠，后者的放熱可能導致蛋白損失。裂解后測完濃度，凍存于-80℃備用。
2.3 變性與上樣
變性時，將樣品在Laemmli 緩沖液中 70–100°C 下加熱 10 分鐘。對于細胞，通常將其加熱到 100℃。組織是更復雜的樣本，加熱到 70℃可保護最“容易”降解的蛋白質。另外，對于多重跨膜蛋白，也不建議煮沸，可能會引起膜的聚集或者膜蛋白的降解，一般建議70℃ 10min或者37℃ 30min。對于可能形成多聚體的指標，要確保中Laemmli 緩沖液中的還原劑有效，最好新鮮配制，DTT長時間會失效，可另外補充。
如果樣品在冰箱里存儲一段時間，上樣前可在70℃煮一下，有助于得到清晰的條帶。細胞樣品建議上樣2–5x105個細胞/泳道的裂解液。由于組織裂解時有許多雜質，上樣80–100µg組織裂解液/泳道。
2.4 電泳與轉膜
對于高分子量蛋白(HMW,分子量>150KD),電泳時Tris-Glycine 4–6% 或Tris-Acetate 3–8%凝膠是最佳選擇,也可根據經驗選擇凝膠。
HMW建議濕轉,在4°C下以100 mA將蛋白質從凝膠轉移到膜上20小時。注意此步驟至關重要,因為它決定了傳輸的有效性。較長的轉移時間將提高 HMW 蛋白質轉移的效率。
2.5 封閉與抗體稀釋
一般產品說明會提供對應抗體的最佳的實驗條件，當您實驗遇到問題，需要優化實驗時，請您優先參照產品說明進行操作。
03 常用實驗protocol
3.1 使用 Laemmli 樣品緩沖液制備細胞裂解液
用冰冷的 PBS 清洗細胞板，重復3次。(對于懸浮細胞,清洗離心后加入裂解液)
將板置于冰上并以 5 × 106細胞/ml 樣品緩沖液的比例加入預冷的樣品緩沖液(62.5 mM Tris(pH 6.8)、2%SDS、10%甘油和100mM DTT)。
用細胞刮刀刮下培養皿并將裂解液收集到微管中。
將樣品在100°C下煮沸5分鐘。
對煮沸的樣品進行超聲處理5秒鐘。
將樣品在4°C下以14,000 rpm的速度離心5分鐘。
將上清液轉移到干凈的微管中,并儲存在-80°C直至進一步使用。
3.2 使用溫和去垢劑制備細胞裂解液
對于IP等應用，我們建議使用溫和的去垢劑(如Triton X-100或NP-40)進行細胞裂解。
用冰冷的PBS清洗細胞板,重復3次。(對于懸浮細胞,清洗離心后加入裂解液)
將板置于冰上并以5 ×106個細胞/ml的比例加入預冷的IP裂解液。
用細胞刮刀刮下培養皿并將裂解液收集到微管中。
在 4°C下將樣品在微管中搖晃30分鐘。
將樣品在 4°C下以14,000 rpm的速度離心10分鐘。
小心地將透明上清液轉移到干凈的微管中。您可以將樣品在-20°C下保存數月或立即與Laemmli樣品緩沖液混合。
3.3 富集膜蛋白制備組織裂解液
從動物身上取出感興趣的組織,并在液氮中快速冷凍。將組織儲存在 -80°C 直至進一步使用。
將冷凍組織放入5倍體積預冷的富集膜蛋白裂解液中。
用 polytron 勻漿器勻漿組織。
在 4°C下以 2,000 xg離心勻漿10分鐘,丟棄大碎片。
將上清液轉移到干凈的微管中,將沉淀重懸在2倍體積的富集膜蛋白裂解液中并重新勻漿。
在4°C下以 2,000 xg離心勻漿10分鐘。將上清液與步驟e中的上清液混合。
將上清液(來自步驟e和f)在4°C下以100,000 xg離心1小時。
丟棄上清液。用2倍體積的富集膜蛋白裂解液重懸沉淀(含有組織膜)，并用 polytron勻漿器短暫勻漿。
使用Bradford方法測量蛋白質濃度。用富集膜蛋白裂解液將蛋白質濃度調整至4 mg/ml。
將蛋白質樣品儲存在-80°C直至進一步使用。
3.4 常規制備組織裂解液
從動物身上取出感興趣的組織/器官，并在液氮中快速冷凍。將組織/器官儲存在-80°C 直至進一步使用。
將冷凍組織放入5倍體積預冷的常規組織裂解液中。
用 polytron 勻漿器勻漿組織。
在 4°C 下旋轉樣品30分鐘。
在 4°C 下以 100,000 xg離心勻漿1小時。
將上清液轉移到干凈的微管中，并使用 Bradford 方法測量蛋白質濃度。使用常規組織裂解液將蛋白質濃度調整至4mg/ml。將裂解液儲存在-80°C下直至進一步使用。
好的研究依賴于穩定高質量的試劑,Alomone離子通道專家(優寧維獨家代理)多年來一直為離子通道研究提供穩定可靠的抗體,小分子化合物等。除了試劑,離子通道研究另一個不可或缺的工具就是—全自動膜片鉗。
Reference：
Caterina MJ, Schumacher MA, Tominaga M, Rosen TA, Levine JD, Julius D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature 1997:389:816-824.
McKemy DD, Neuhausser WM, Julius D. Identification of a cold receptor reveals a general role for TRP channels in thermosensation. Nature 2002:416:52-58
Coste B, Mathur J, Schmidt M, Earley TJ, Ranade S, Petrus MJ, Dubin AE, Patapoutian A. Piezo1 and Piezo2 are essential components of distinct mechanically activated cation channels. Science 2010:330: 55-60
Janes, K. A. (2016). An Analysis of Critical Factors for Quantitative Immunoblotting. Sci Signal. ; 8(371): rs2. doi:10.1126/scisignal.2005966.
https://www.alomone.com/support/protocols
2021年的諾獎頒發給了戴維·朱利葉斯和阿登·帕塔普蒂安,以表彰他們在“發現溫度和觸覺感受器”方面作出的貢獻，主要是新的離子通道蛋白TRPV1和Piezo。之前的文章，小優跟大家一起回顧了兩位大佬的發現之旅。其實，這是離子通道領域第三個諾獎。1991年，埃爾溫·內爾以及伯特·薩克曼由于發明膜片箝電位記錄技術，證實離子通道獲獎。2003年，頒發給了發現水通道的彼得·阿格雷和利用X射線晶體成像技術展現離子通道結構的羅德里克·麥金農。
圖1 離子通道蛋白
離子通道蛋白的研究方法
針對離子通道的研究逐漸涉及許多科學技術，例如電生理學，免疫學，基因工程和影像學等。隨著研究體系的發展，目前形成通過基因工程選擇特定基因，構建文庫，過表達或者敲除等方式進行篩選; 通過膜片鉗技術觀察電位變化；免疫學和影像學進行后續的蛋白結構、位置、表達水平的鑒定。其中免疫學中最常見的實驗方法是免疫印跡(WB)，但我們發現在用WB研究離子通道蛋白的過程中，經常結果不盡人意。鑒于離子通道蛋白的特性，要想WB一次成功，小優細節君整理了如下Tips，希望能夠幫到您。
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學科 |
主要技術 |
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電生理學 |
電壓鉗位法、膜片鉗技術 |
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基因工程 |
異源功能互補,過表達,基因沉默,GFP標記、原位雜交和qPCR等 |
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免疫學 |
免疫組織化學、免疫熒光、免疫印跡和免疫電鏡等 |
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影像學 |
Ca2+拮抗熒光術、放射自顯影、X射線晶體成像和冷凍電鏡等 |
01 離子通道蛋白的主要特征
|
1. 具有多重跨膜結構域 |
2. 分子量較大 |
|
3. 具有同源或異源多聚體 |
4. 結構復雜 |
圖2 CaV2.1跨膜結構域
02 離子通道蛋白WB實驗的注意事項
2.1 樣品類型與蛋白特征
樣品制備是任何蛋白質印跡 (WB) 中至關重要的第一步。您使用的制備方案取決于您計劃使用的樣品類型和蛋白特征。
對于細胞（貼壁/懸浮）樣品，建議直接用Laemmli樣品緩沖液,該方法將幾乎所有細胞蛋白質釋放到緩沖液中。如果后續要做IP，應該使用溫和去垢劑（Triton X-100或者NP-40）制備細胞系。對于組織樣品，例如，從心臟、腦組織和脂肪組織中提取相同蛋白質的最佳方法不一定是相同的。通常，可以同時嘗試兩種裂解方案，比如“富集膜蛋白”或“常規制備”，最后選擇對目的蛋白最合適的方案。
此外，還需要考慮蛋白質的亞細胞定位（例如，質膜蛋白和核蛋白需要不同的樣品制備方法），以及目標蛋白是否富含脂筏等特定微結構域(低溫下脂筏能抵抗非離子去垢劑的抽提，超聲有助于裂解過程)。當目的蛋白豐度很低時，還需要濃縮膜組分。蛋白具有多重跨膜結構域時，需要注意防止蛋白聚集或降解。
2.2 裂解液與裂解方式
對組織或細胞樣品進行裂解是為了釋放目的蛋白、不同裂解緩沖液對蛋白溶解能力各不相同。現在裂解液市面上有很多，有RIPA，NP-40，Triton X-100，SDS等，那我們如何去做選擇呢？
離子通道抗體廠家Alomone不建議使用RIPA進行裂解樣品，RIPA往往會“破壞”膜蛋白，導致膜蛋白降解，特別不適合多重跨膜蛋白和易降解膜蛋白。另外，RIPA 裂解液提取蛋白已被證實有10-30%的蛋白會丟失在不可溶組分中。Laemmli樣品緩沖液釋放更加全面。有些蛋白對于降解非常敏感，可以嘗試不同的樣品裂解液。
在裂解組織蛋白時，請注意全程需在冰上操作，裂解時需加入cocktail形式的蛋白酶體抑制劑。對于核蛋白和富含脂筏的，裂解時強烈建議超聲處理，可以更大程度釋放蛋白。組織勻漿時，避免使用勻漿珠，后者的放熱可能導致蛋白損失。裂解后測完濃度，凍存于-80℃備用。
2.3 變性與上樣
變性時，將樣品在Laemmli 緩沖液中 70–100°C 下加熱 10 分鐘。對于細胞，通常將其加熱到 100℃。組織是更復雜的樣本，加熱到 70℃可保護最“容易”降解的蛋白質。另外，對于多重跨膜蛋白，也不建議煮沸，可能會引起膜的聚集或者膜蛋白的降解，一般建議70℃ 10min或者37℃ 30min。對于可能形成多聚體的指標，要確保中Laemmli 緩沖液中的還原劑有效，最好新鮮配制，DTT長時間會失效，可另外補充。
如果樣品在冰箱里存儲一段時間，上樣前可在70℃煮一下，有助于得到清晰的條帶。細胞樣品建議上樣2–5x105個細胞/泳道的裂解液。由于組織裂解時有許多雜質，上樣80–100µg組織裂解液/泳道。
圖3 煮沸可能引起膜蛋白降解
2.4 電泳與轉膜
對于高分子量蛋白(HMW,分子量>150KD),電泳時Tris-Glycine 4–6% 或Tris-Acetate 3–8%凝膠是最佳選擇,也可根據經驗選擇凝膠。
HMW建議濕轉,在4°C下以100 mA將蛋白質從凝膠轉移到膜上20小時。注意此步驟至關重要,因為它決定了傳輸的有效性。較長的轉移時間將提高 HMW 蛋白質轉移的效率。
2.5 封閉與抗體稀釋
一般產品說明會提供對應抗體的最佳的實驗條件，當您實驗遇到問題，需要優化實驗時，請您優先參照產品說明進行操作。
03 常用實驗protocol
3.1 使用 Laemmli 樣品緩沖液制備細胞裂解液
用冰冷的 PBS 清洗細胞板，重復3次。(對于懸浮細胞,清洗離心后加入裂解液)
將板置于冰上并以 5 × 106細胞/ml 樣品緩沖液的比例加入預冷的樣品緩沖液(62.5 mM Tris(pH 6.8)、2%SDS、10%甘油和100mM DTT)。
用細胞刮刀刮下培養皿并將裂解液收集到微管中。
將樣品在100°C下煮沸5分鐘。
對煮沸的樣品進行超聲處理5秒鐘。
將樣品在4°C下以14,000 rpm的速度離心5分鐘。
將上清液轉移到干凈的微管中,并儲存在-80°C直至進一步使用。
3.2 使用溫和去垢劑制備細胞裂解液
對于IP等應用，我們建議使用溫和的去垢劑(如Triton X-100或NP-40)進行細胞裂解。
用冰冷的PBS清洗細胞板,重復3次。(對于懸浮細胞,清洗離心后加入裂解液)
將板置于冰上并以5 ×106個細胞/ml的比例加入預冷的IP裂解液。
用細胞刮刀刮下培養皿并將裂解液收集到微管中。
在 4°C下將樣品在微管中搖晃30分鐘。
將樣品在 4°C下以14,000 rpm的速度離心10分鐘。
小心地將透明上清液轉移到干凈的微管中。您可以將樣品在-20°C下保存數月或立即與Laemmli樣品緩沖液混合。
3.3 富集膜蛋白制備組織裂解液
從動物身上取出感興趣的組織,并在液氮中快速冷凍。將組織儲存在 -80°C 直至進一步使用。
將冷凍組織放入5倍體積預冷的富集膜蛋白裂解液中。
用 polytron 勻漿器勻漿組織。
在 4°C下以 2,000 xg離心勻漿10分鐘,丟棄大碎片。
將上清液轉移到干凈的微管中,將沉淀重懸在2倍體積的富集膜蛋白裂解液中并重新勻漿。
在4°C下以 2,000 xg離心勻漿10分鐘。將上清液與步驟e中的上清液混合。
將上清液(來自步驟e和f)在4°C下以100,000 xg離心1小時。
丟棄上清液。用2倍體積的富集膜蛋白裂解液重懸沉淀(含有組織膜)，并用 polytron勻漿器短暫勻漿。
使用Bradford方法測量蛋白質濃度。用富集膜蛋白裂解液將蛋白質濃度調整至4 mg/ml。
將蛋白質樣品儲存在-80°C直至進一步使用。
3.4 常規制備組織裂解液
從動物身上取出感興趣的組織/器官，并在液氮中快速冷凍。將組織/器官儲存在-80°C 直至進一步使用。
將冷凍組織放入5倍體積預冷的常規組織裂解液中。
用 polytron 勻漿器勻漿組織。
在 4°C 下旋轉樣品30分鐘。
在 4°C 下以 100,000 xg離心勻漿1小時。
將上清液轉移到干凈的微管中，并使用 Bradford 方法測量蛋白質濃度。使用常規組織裂解液將蛋白質濃度調整至4mg/ml。將裂解液儲存在-80°C下直至進一步使用。
好的研究依賴于穩定高質量的試劑,Alomone離子通道專家(優寧維獨家代理)多年來一直為離子通道研究提供穩定可靠的抗體,小分子化合物等。除了試劑,離子通道研究另一個不可或缺的工具就是—全自動膜片鉗。
Reference：
Caterina MJ, Schumacher MA, Tominaga M, Rosen TA, Levine JD, Julius D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature 1997:389:816-824.
McKemy DD, Neuhausser WM, Julius D. Identification of a cold receptor reveals a general role for TRP channels in thermosensation. Nature 2002:416:52-58
Coste B, Mathur J, Schmidt M, Earley TJ, Ranade S, Petrus MJ, Dubin AE, Patapoutian A. Piezo1 and Piezo2 are essential components of distinct mechanically activated cation channels. Science 2010:330: 55-60
Janes, K. A. (2016). An Analysis of Critical Factors for Quantitative Immunoblotting. Sci Signal. ; 8(371): rs2. doi:10.1126/scisignal.2005966.
https://www.alomone.com/support/protocols
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