標簽蛋白純化實戰(zhàn)小技巧
1、想要純化一個蛋白，是否應立即開始純化實驗操作？
答：不用著急立刻實驗，在實驗開始前，應該先確定目標蛋白的性質(zhì)，例如分子量，等電點，可溶性，穩(wěn)定性等等，這些數(shù)據(jù)可以查找相關的文獻或者Uniprot等蛋白數(shù)據(jù)庫；
其次，還應該確定純化目標，不同用途對于純化的蛋白量，純度，活性和均一性都有不同要求；
答：不用著急立刻實驗，在實驗開始前，應該先確定目標蛋白的性質(zhì)，例如分子量，等電點，可溶性，穩(wěn)定性等等，這些數(shù)據(jù)可以查找相關的文獻或者Uniprot等蛋白數(shù)據(jù)庫；
其次，還應該確定純化目標，不同用途對于純化的蛋白量，純度，活性和均一性都有不同要求；
最后，還需要根據(jù)CIPP層析策略設計純化方案，合理利用每個層析方法的特點，提高蛋白的純度和減少蛋白蛋白損失。
2、一個完整的親和層析實驗包括哪些步驟？
答：親和層析的實驗步驟一般分為5個階段，包括平衡、上樣、洗雜、洗脫、再生。
答：親和層析的實驗步驟一般分為5個階段，包括平衡、上樣、洗雜、洗脫、再生。
3、His標簽蛋白純化結(jié)合緩沖液中也要加咪唑？
答：是的，我們建議您在結(jié)合緩沖液中也可以加入少量的咪唑（20-40mM），以減少雜蛋白的非特異性吸附。
4、如何提高His標簽蛋白純化的純度？
答：可以嘗試：
（1）使用線性洗脫的方式：500 mM咪唑，0%-100%線性梯度洗脫10 CV；
（2）在鎳柱純化之后增加離子交換和分子篩等步驟繼續(xù)純化；
（3）結(jié)合緩沖液中加入少量咪唑；
（4）其他考慮方向包括His標簽蛋白被部分降解，優(yōu)化結(jié)合和洗脫條件，嘗試不同金屬離子螯合的填料，構(gòu)建雙標簽蛋白，添加去垢劑，還原劑等添加劑破壞雜質(zhì)和目的蛋白間的相互作用等等
答：可以嘗試：
（1）使用線性洗脫的方式：500 mM咪唑，0%-100%線性梯度洗脫10 CV；
（2）在鎳柱純化之后增加離子交換和分子篩等步驟繼續(xù)純化；
（3）結(jié)合緩沖液中加入少量咪唑；
（4）其他考慮方向包括His標簽蛋白被部分降解，優(yōu)化結(jié)合和洗脫條件，嘗試不同金屬離子螯合的填料，構(gòu)建雙標簽蛋白，添加去垢劑，還原劑等添加劑破壞雜質(zhì)和目的蛋白間的相互作用等等
5、Ni Sepharose excel和Ni Sepharose HP、FF有什么區(qū)別，如何選擇？
答：這3款填料都是Cytiva非常經(jīng)典的His標簽純化產(chǎn)品，各有特點：
答：這3款填料都是Cytiva非常經(jīng)典的His標簽純化產(chǎn)品，各有特點：
（1）HP（High Performance）
高性能，填料平均顆粒粒徑約34 μm，更細的顆粒能帶來更高分辨率的分離純化。經(jīng)過HP純化后樣品峰更窄，濃度高且收集體積小，節(jié)省了后續(xù)濃縮步驟的時間。
（2）FF（Fast Flow）
快流速，填料平均顆粒粒徑約90 μm，具有良好的分辨率及輕松實現(xiàn)規(guī)模擴大的分離純化，更適用于Batch/重力流下的蛋白純化和多孔板篩選。
如果純化包涵體蛋白較多，可以優(yōu)先考慮FF或FF Crude（樣品可無需過濾直接上樣Crude預裝柱，大大節(jié)省樣品的前處理時間）。
（3）Ni Sepharose Excel
鎳脫落極低，而且能耐受100 mM EDTA。適合真核分泌表達的蛋白，同時可以直接不脫鎳進行堿洗。
6、Ni Sepharose FF、HP、Excel 應該如何清潔再生？
答：
答：
（1）對于Ni Sepharose FF、HP：
•首先需要用20 mM sodium phosphate，500 mM NaCl，50 mM EDTA，pH 7.4 脫鎳；
•再按CIP protocols進行清洗（不脫鎳直接上堿洗可能會產(chǎn)生棕色沉淀導致柱子堵塞）；
•脫鎳后可以用0.5-1 M NaOH清洗+水洗，再用100 mM NiSO4掛鎳；
•結(jié)束后先水洗，保存在20%乙醇中。
•再按CIP protocols進行清洗（不脫鎳直接上堿洗可能會產(chǎn)生棕色沉淀導致柱子堵塞）；
•脫鎳后可以用0.5-1 M NaOH清洗+水洗，再用100 mM NiSO4掛鎳；
•結(jié)束后先水洗，保存在20%乙醇中。
（2）對于Ni Sepharose Excel：
•無需脫鎳可以直接用0.5-1 M NaOH進行清洗+水洗。
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蛋白純化
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