生物制品宿主細胞蛋白（HCPs）殘留的檢測方法、法規(guī)與挑戰(zhàn)

一、HCPs
在生物制品的生產(chǎn)過程中，宿主細胞扮演著關(guān)鍵的角色，是生產(chǎn)重組蛋白、抗體藥物或疫苗藥物等的重要起始材料。常見的宿主細胞類型涵蓋了細菌細胞（如大腸桿菌）、酵母細胞（如釀酒酵母）以及哺乳動物細胞（如中國倉鼠卵巢（CHO）細胞和人胚胎腎（HEK）細胞）等。

然而，作為生物制品中的非目標(biāo)成分，宿主細胞蛋白（HCPs）的殘留問題不容忽視。HCPs 主要包括宿主細胞分泌的蛋白以及因細胞凋亡、代謝產(chǎn)生的部分結(jié)構(gòu)蛋白。這些殘留的 HCPs 具有潛在的安全風(fēng)險，一方面可能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，引發(fā)不良反應(yīng)；另一方面，某些具有酶活性的 HCPs 還可能影響終產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的組成，進而對產(chǎn)品的穩(wěn)定性造成威脅。

因此，HCPs 被視為生物制品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA），在生物制品的成品和原液放行檢測以及中間產(chǎn)品的工藝控制中都需要重點關(guān)注。即便經(jīng)過復(fù)雜的純化工藝，最終的生物制品中仍可能殘留低濃度（1~100 ppm）的 HCPs，這凸顯了建立有效檢測方法的緊迫性。

二、法規(guī)引領(lǐng)
為確保生物制藥產(chǎn)品的安全性、有效性和質(zhì)量，各國監(jiān)管機構(gòu)對 HCPs 的控制制定了多層次、多方面的法規(guī)要求。

從國際法規(guī)來看，美國藥典（USP）的 <1132> 章節(jié)明確規(guī)定，需采用靈敏度較高的方法檢測藥品中的 HCP，其含量應(yīng)低于檢測限，通常小于 100ppm（即 1mg 總蛋白中 HCP 含量應(yīng)小于 100ng，也即 < 0.01%）。國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會（ICH）的 Q6B 指南指出，要依據(jù) ICH 準(zhǔn)則，運用敏感且經(jīng)過驗證的有效方法來監(jiān)控殘留的 HCP，其殘留量一般要求小于 100ppm。歐洲藥典（EP）在 2.6.34 中規(guī)定，生物制品中 HCP 的含量應(yīng)當(dāng)小于 0.1%。

中國藥典也對不同宿主細胞來源的生物制品中 HCP 殘留量做出了明確規(guī)定：CHO 細胞來源的生物制品，HCP 殘留需 < 0.05%（相當(dāng)于小于 500ppm）；E.coli 來源的，HCP 殘留需 < 0.01%（相當(dāng)于小于 100 ppm）；假單胞菌來源的，HCP 殘留需 < 0.02%（相當(dāng)于小于 200 ppm）。其他國家和地區(qū)的藥典也各自制定了相應(yīng)的 HCP 殘留標(biāo)準(zhǔn)，共同致力于保障生物制藥產(chǎn)品的質(zhì)量與安全。制藥企業(yè)必須嚴(yán)格遵守這些法規(guī)要求，選擇合適的檢測方法和控制策略，確保 HCP 殘留量處于可接受的范圍之內(nèi)。

三、檢測手段
目前，測定生物制品中殘留 HCPs 的方法豐富多樣，主要可分為基于特異性抗體的方法和非免疫特異性方法。

（一）基于特異性抗體的方法
1. 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：作為目前 HCP 檢測最常用的方法，ELISA 利用抗原抗體反應(yīng)，通過標(biāo)記的酶催化底物產(chǎn)生顏色變化來實現(xiàn)對 HCPs 的檢測和定量。其優(yōu)點顯著，具有高靈敏度和特異性，能夠檢測到低至 ng/mL 級別的 HCPs；操作相對簡單，適合大規(guī)模篩選且自動化程度高；還可以提供精確的 HCPs 濃度數(shù)據(jù)。然而，ELISA 也存在一定的局限性，它高度依賴特定的抗體，抗體的制備和驗證成本高且耗時；對于某些 HCPs 可能缺乏合適的抗體，導(dǎo)致漏檢；同時還可能存在抗體的交叉反應(yīng)，影響檢測的準(zhǔn)確性。ELISA 主要應(yīng)用于工藝開發(fā)中監(jiān)測不同工藝步驟的 HCPs 水平，以及作為最終產(chǎn)品放行的關(guān)鍵檢測方法，適用于需要高靈敏度和高通量的 HCPs 檢測場景。

2. 免疫印跡（Western Blot）：該方法先將 SDS-PAGE 分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，再用特異性抗體檢測目標(biāo) HCPs，通過化學(xué)發(fā)光或顯色進行信號檢測。免疫印跡的特異性高，能夠針對特定 HCPs 進行檢測，并提供定性和相對定量信息。但它操作復(fù)雜、耗時較長，適合小規(guī)模分析，且同樣依賴特異性抗體，抗體制備和驗證成本高，靈敏度也受到檢測方法和抗體的限制。免疫印跡主要用于特定 HCPs 的檢測，以確認和驗證 ELISA 檢測結(jié)果，以及在研發(fā)階段對特定 HCPs 進行深入研究。

（二）非免疫特異性方法
1. 質(zhì)譜分析（Mass Spectrometry, MS）：質(zhì)譜通過電離樣品分子，并依據(jù)其質(zhì)量電荷比進行分離和檢測，能夠提供 HCPs 的定性和定量信息。其優(yōu)點包括高靈敏度和分辨率，能檢測和區(qū)分多種 HCPs；無需特定抗體，適用于未知或新發(fā)現(xiàn)的 HCPs；還能提供分子量、氨基酸序列等詳細信息。但質(zhì)譜分析操作復(fù)雜，樣品制備和數(shù)據(jù)分析難度大，設(shè)備昂貴，需要高成本的儀器和技術(shù)支持，且分析時間長，更適合小規(guī)模、詳細分析，不適用于高通量篩查。質(zhì)譜主要應(yīng)用于 HCPs 的鑒定，識別和定量復(fù)雜混合物中的 HCPs，以及在抗體開發(fā)中確認和驗證 ELISA 抗體的靶標(biāo)。

2. SDS-PAGE 結(jié)合蛋白質(zhì)染色：此方法通過 SDS-PAGE 將蛋白質(zhì)根據(jù)分子量分離，然后用染料（如考馬斯亮藍或銀染）進行染色，以檢測 HCPs 的總量和分布。它操作簡單、成本低、設(shè)備要求低，能夠直觀可視化 HCPs 的分布和相對濃度。但該方法靈敏度低，僅能檢測較高濃度的 HCPs（μg/mL 級別），難以提供精確的 HCPs 濃度，分辨率也有限，難以區(qū)分分子量相近的 HCPs。主要適用于初步篩選，快速評估 HCPs 的總量和大致分布，以及工藝監(jiān)控中用于工藝優(yōu)化和不同批次之間的比較。

3. 毛細管電泳（Capillary Electrophoresis, CE）：CE 通過毛細管內(nèi)的電場分離蛋白質(zhì)，依據(jù)電泳遷移率差異檢測 HCPs。它具有高分辨率，能精確分離不同 HCPs，自動化程度高，適合高通量分析。但設(shè)備昂貴，需要高成本的設(shè)備和維護，技術(shù)要求高，樣品制備復(fù)雜，分析時間較長，對某些 HCPs 可能靈敏度不夠。主要應(yīng)用于質(zhì)量控制中進行詳細的 HCPs 分析，以及工藝優(yōu)化中用于監(jiān)控生物制品生產(chǎn)過程。

4. 高效液相色譜（HPLC）：HPLC 通過液相色譜柱分離 HCPs，根據(jù)不同的保留時間進行檢測和定量。它具有高靈敏度和分辨率，能分離和定量不同 HCPs，自動化程度高，適合定量分析。但設(shè)備昂貴，需要高成本的儀器和技術(shù)支持，樣品制備復(fù)雜，時間長，分析速度較慢，且需要結(jié)合其他檢測手段（如 MS）才能準(zhǔn)確識別 HCPs。主要應(yīng)用于質(zhì)量控制中進行詳細的 HCPs 分析和定量，以及研發(fā)階段用于優(yōu)化和監(jiān)控生物制品生產(chǎn)過程。

5. 多種技術(shù)結(jié)合（如 ELISA 與 MS 結(jié)合）：綜合利用 ELISA 和質(zhì)譜等方法的優(yōu)勢進行 HCPs 的檢測和分析，能夠提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性，提供更全面的 HCPs 信息。但操作復(fù)雜，需要多種設(shè)備和技術(shù)支持，時間和成本增加，技術(shù)要求高，需要多種技術(shù)人員的協(xié)同工作。主要應(yīng)用于質(zhì)量控制中確保最終產(chǎn)品的 HCPs 水平符合標(biāo)準(zhǔn)，以及工藝優(yōu)化中用于工藝開發(fā)和優(yōu)化階段的全面 HCPs 分析。

四、未來展望
盡管 ELISA 是目前 HCPs 殘留的主要質(zhì)控方法，但它存在諸多局限性。其準(zhǔn)確性高度依賴抗體的特異性，無法獲得 HCPs 的種類及其含量分布信息，需要使用正交方法進行全面監(jiān)測。例如，商業(yè)化的 HCP ELISA 試劑盒抗體特異性和適用性低，容易出現(xiàn)漏檢，且更換批次時需再次驗證。在單克隆抗體藥物生產(chǎn)中，HCPs 殘留可被蛋白 A 有效去除，但在基因治療藥物（如 AAV 和溶酶病毒等）生產(chǎn)中，缺乏相應(yīng)的 HCPs 去除工藝，因此對于某些生物制品，結(jié)合多種檢測方法分析和檢測 HCPs 殘留顯得尤為重要。

為彌補 ELISA 的不足，液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）逐漸成為一種高通量、高靈敏度檢測 HCPs 殘留的方法。質(zhì)譜法可在單次實驗中鑒定和定量多種 HCPs，不存在抗體法對無親和力或低親和力 HCPs 的歧視，可應(yīng)用于生物制品全生命周期的 HCPs 監(jiān)控。此外，對于缺乏商品化 ELISA 試劑盒的宿主細胞，LC-MS 法的開發(fā)周期短，可在 1 個月內(nèi)完成，能快速應(yīng)用于殘留 HCPs 的檢測。

2023 年 5 月，美國藥典發(fā)布的 “質(zhì)譜法測定生物藥中殘留宿主細胞蛋白”(征求意見稿)，進一步推動和規(guī)范了 LC-MS 法在 HCP 分析檢測中的應(yīng)用，為未來 HCPs 檢測技術(shù)的發(fā)展指明了方向。隨著技術(shù)的不斷進步，相信在 HCPs 檢測領(lǐng)域?qū)�會取得更多的突破，為生物制品的質(zhì)量和安全提供更有力的保障。

產(chǎn)品信息


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