抗體內化的分子機制、途徑探索、影響因素及在ADC藥物研發(fā)中的作用
在抗體偶聯(lián)藥物（Antibody - drug conjugates，ADC）的復雜體系中，抗體內化是 ADC 藥物發(fā)揮作用的關鍵環(huán)節(jié)。抗體作為 ADC 藥物的重要組成部分，其內化能力直接影響藥物療效與安全性。
一、抗體內化的分子機制與途徑探索
1.抗體內化的本質與細胞旅程
抗體內化，即抗體內吞，指細胞表面抗體與對應抗原結合后，借助細胞自身運輸體系，將抗體 - 抗原復合物轉運至細胞內部并發(fā)揮特定生物學功能的過程。大多數(shù) ADC 藥物分子以此方式進入細胞發(fā)揮對腫瘤細胞的毒性效應。常規(guī)內吞作用一般分為芽形成、膜彎曲與囊泡成熟、膜分裂并釋放至細胞質三個階段，為抗體內化提供了基本細胞生理基礎。
2.ADC 藥物內化途徑的精細分類
對已上市 ADC 藥物內化方式的研究表明，其內化途徑依據(jù)是否依賴網格蛋白，可分為網格蛋白介導的內吞作用（CME）與網格蛋白非依賴性內吞作用兩類。其中，網格蛋白非依賴性內吞作用又進一步細分為小窩蛋白介導的內吞作用、小窩蛋白非依賴性載體蛋白 / GPI 錨定蛋白富集的早期內體區(qū)室（CLIC/GEEC）和巨胞飲作用。
網格蛋白介導的內吞作用是 ADC 藥物內吞的重要途徑，其過程包含一系列緊密相連且部分重疊的步驟。不同受體觸發(fā) CME 的機制存在差異，既可以由質膜上某些受體組成型啟動，也能通過受體與配體和 / 或抗體結合來開啟。當細胞質中的內吞衣殼蛋白開始在質膜內小葉聚集時，CME 起始。衣殼蛋白通過募集細胞質中的額外接頭蛋白并與之相互作用，持續(xù)組裝與生長。關鍵銜接蛋白促使膜彎曲，將內化受體 / 配體聚集到 “網格蛋白包被坑”（CCP）中。隨著 CCP 內陷加深，其頸部收縮，通過斷裂過程與質膜分離。肌動蛋白聚合助力 CCP “向內” 進入細胞質，直至分裂完成，CCP 轉變?yōu)榫W格蛋白包被的囊泡（CCV）。最終，CCV 外殼解體，CCV 與內體融合并分選至特定亞細胞位置，或者循環(huán)回到細胞表面。這一過程的各步驟精確有序，確保了抗體內化的高效進行。
二、影響抗體內化的多元因素剖析
1.靶點
抗體能否被內化，靶點起決定性作用。不同靶點具有特定結構，只有與之匹配的抗體才能啟動內化進程。而抗體內化效率受多方面因素綜合影響。
2.抗體自身特性的影響
抗體的親和力與特異性對其內化有重要影響。親和力高的抗體與抗原結合能力強，為內化提供動力；特異性高的抗體能精準識別抗原，避免非特異性結合，確保內化的準確性與高效性。
不同類型和亞型的抗體，通過不同的受體和信號通路影響內化速度與效率。例如，IgG 和 IgA 內化速度相對較快，而 IgM 和 IgE 內化速度較慢，這反映了不同抗體在細胞內運輸機制上的差異。
抗體的劑量和濃度對其內化呈 “雙刃劍” 效應。劑量和濃度增加，抗體與抗原結合機會增多，內化可能性增大；但過高劑量和濃度可能導致受體飽和或下調，降低內化效果。
3.細胞因素的影響
不同類型細胞的受體表達和內化能力不同。B 細胞和巨噬細胞內化能力較強，T 細胞和紅細胞內化能力較弱，這種天然差異顯著影響抗體內化效果。
細胞狀態(tài)是影響內化動力學的重要因素。活化細胞內化速度較快，凋亡細胞內化速度顯著減慢。此外，分子量較大的抗原通常更難被細胞內化；針對同一靶點的不同抗體，因結構等因素也會展現(xiàn)出不同的內化效率。因此，在 ADC 藥物研發(fā)中，篩選高內化效率的抗體對確保藥物安全性與有效性至關重要。
三、抗體內化檢測技術的全景透視
1.基于活細胞成像的內化檢測
基于活細胞成像的內化檢測（Incucyte），通過實時活細胞成像儀對裸抗進行藥效動力學實時監(jiān)測。與傳統(tǒng)終點檢測不同，它采用多濃度點、多時間點檢測模式，可對活細胞進行長達 72 小時的連續(xù)觀察。這種動態(tài)監(jiān)測方式為深入了解抗體內化過程提供了豐富時間序列數(shù)據(jù)，是研究抗體內化的有力工具。
2.基于毒素偶聯(lián)的殺傷檢測
基于毒素偶聯(lián)的殺傷檢測主要包括 DT3C 法與 Mab - ZAP 方法。這兩種方法均利用抗體 - 毒素復合物在細胞內釋放毒素引發(fā)細胞毒性的原理，通過檢測細胞殺傷情況評估抗體的內化效果。DT3C 是 2014 年 MikiYamaguchi 等人利用基因重組技術生產的重組蛋白，由無受體結合域的白喉毒素（DT）和鏈球菌蛋白 G 的 C1、C2、C3（3C）結構域構成；Mab - ZAP 由小鼠抗體和核糖體失活蛋白皂草素組成。相較于傳統(tǒng)的 Mab - ZAP 方法，DT3C 法中的 mAb - DT3C 偶聯(lián)物具有分子量更穩(wěn)定、內化效率更高、適用性更廣、成本更低等優(yōu)勢，為抗體內化檢測提供了更優(yōu)化選擇。
3.基于 pH 探針與溫度轉變的內化檢測
基于 pH 探針的內化檢測與基于溫度轉變的熒光二抗內化檢測是細胞內化過程檢測的常用方法。基于 pH 探針的內化檢測利用熒光探針對 pH 值的敏感性，通過反映細胞內囊泡的酸化程度判斷內化進程與位置；基于溫度轉變的熒光二抗內化檢測利用熒光二抗在不同溫度下熒光強度的變化，區(qū)分細胞內外的熒光信號，進而判斷內化效率與程度。
不過，這兩種方法各有優(yōu)缺點。基于 pH 探針的內化檢測操作簡便，熒光信號清晰且可定量分析，適用于高通量篩選，但需精準選擇合適的 pH 敏感探針，并應對其可能受到的多種干擾因素；基于溫度轉變的熒光二抗內化檢測則需精確控制溫度變化，同時要考慮不同熒光二抗的溫度敏感性差異以及溫度轉變對細胞生理狀態(tài)和內化動力學的潛在影響。
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