基于CERO生物反應器的人類干細胞規模懸浮擴增方法介紹
本文介紹了一種可重復且多功能的人類多能干細胞（hPSC）動態懸浮擴增系統，通過OLS CERO臺式細胞生物反應器，將 hPSC 以未分化聚集物形式培養。研究表明，在mTeSR 或 E8 培養基中進行 10 代長期擴增后，hPSC 仍保持正常核型、三胚層分化潛能及多能性標志物的高表達。該系統支持低至0.3×10⁵ cells/mL 的接種密度，提供了簡化、經濟且省時的中規模 hPSC 制備方法，對推進基于 hiPSC 的醫學研究中的細胞制造具有重要意義。
CERO 3D細胞（類器官)生物反應器
CERO 3D細胞（類器官)生物反應器
1. 研究背景
隨著人類誘導多能干細胞（hiPSC）在疾病建模、藥物篩選等領域的應用，亟需標準化、自動化、低成本的 hPSC 擴增技術。
現有生物反應器多適用于大規模生產，存在體積大、需大量培養基、操作復雜、依賴專業人員等問題，難以滿足多患者特異性 hiPSC 系的平行小規模擴增需求。
因此，研究旨在開發一種適用于中規模、平行化、簡單高效的 hPSC 懸浮擴增系統。
2. 材料與方法
細胞類型：
人誘導多能干細胞（hiPSC）：iLB-C-31f-r1（源自真皮成纖維細胞）
人胚胎干細胞（hESC）：H9
培養系統：
OLS CERO臺式細胞生物反應器：含 4 個 50mL 一次性培養容器，具備溫度控制（37℃）、CO₂濃度控制、旋轉攪拌（維持聚集物懸浮及營養供應），參數可通過觸摸屏設置并保存。
培養方案：
接種：從 2D 培養收獲單細胞，以 0.33-2.0×10⁵ cells/mL 密度接種至 10mL 培養基（含 10μM ROCK 抑制劑）。
培養：每日添加 5mL 培養基（mTeSR 培養 4 天，E8 需縮短周期），通過調整旋轉速度控制聚集物大小。
傳代：聚集物沉降后離心，經 Accutase 處理為單細胞，重新接種。
檢測方法：
多能性驗證：免疫熒光（檢測 Oct-4、Nanog、Tra1-60 等）、流式細胞術（Tra1-60 表達）。
分化潛能：三胚層分化實驗（檢測 AFP、SMA、TUBB3 等標志物）、TaqMan® hPSC Scorecard™ Panel。
基因組穩定性：SNP 芯片分析。
代謝分析：葡萄糖和乳酸濃度檢測（YSI 2700 分析儀）。
3. 研究結果
3D 懸浮培養體系的建立：
在 mTeSR 中，以 7.5×10⁴ cells/mL 接種時，4 天內擴增倍數達 4.9±2.1，Tra1-60 表達 > 90%。
形成均一圓形聚集物，平均直徑 140±36μm（mTeSR）、138±24μm（E8）。
長期擴增能力（10 代）：
擴增率：hESC 為 5.42±2.87，hiPSC 為 5.09±3.20（mTeSR）；E8 中 hESC 擴增率 7.1±3.4，與 mTeSR 無顯著差異。
多能性維持：持續高表達 Tra1-60（>90%）、Oct-4、Nanog，無分化標志物表達。
基因組與分化潛能：SNP 分析證實核型穩定，三胚層分化實驗及 Scorecard 檢測顯示分化能力未受影響。
mTeSR 與 E8 培養基對比（如下表）：
2D 與 3D 培養轉換：hPSC 在 2D 與 3D 培養間切換后，仍保持典型克隆形態及高表達多能性標志物（Tra1-60>90%）。
4. 討論與意義
該系統解決了現有技術的痛點，實現了 hPSC 的中規模、平行化、低成本擴增，操作簡單且無需專業培訓。
支持從低接種密度起始，且能長期維持 hPSC 的多能性和基因組穩定性，適用于 hiPSC 生物銀行建設和疾病建模。
兼容 mTeSR（ undefined ）和 E8（化學定義、無血清）兩種培養基，其中 E8 的應用為臨床級細胞生產提供了可能。
2D 與 3D 培養的無縫轉換便于整合下游 2D 分化實驗，拓展了其在基礎研究和應用中的實用性。
關鍵問題：
該 hPSC 懸浮擴增系統相比傳統培養方法有哪些核心優勢？
答：核心優勢包括：①操作簡化：使用 OLS CERO臺式反應器，無需復雜設備或專業培訓，支持 4 個樣本平行培養；②成本與效率：可從低至 0.3×10⁵ cells/mL 的密度起始，每日僅需添加培養基（無需 80% 換液），降低試劑消耗和操作時間；③穩定性：10 代擴增后仍保持正常核型、三胚層分化潛能及多能性；④靈活性：支持 2D 與 3D 培養無縫轉換，兼容 mTeSR 和 E8 兩種培養基。
mTeSR 和 E8 培養基在該系統中應用時的主要差異是什么？
答：主要差異體現在培養周期和代謝動力學：①培養周期：mTeSR 可維持 4 天培養，Tra1-60 表達仍 > 90%；E8 中 Tra1-60 表達在第 3 天達高峰（88.4±1.7%），第 4 天顯著下降（61.8±29.3%），需縮短培養周期；②代謝：mTeSR 中葡萄糖消耗和乳酸產生從第 4 天驟升，E8 則從第 3 天開始；③擴增倍數：低接種密度下，mTeSR 最大擴增 20 倍，E8 為 14 倍，但兩者長期平均擴增率無顯著差異。
該系統對基于 hiPSC 的醫學研究有何推動作用？
答：①標準化細胞制造：提供可重復的擴增方法，減少批次差異，利于多中心研究數據比對；②支持大規模生物銀行：可平行擴增多患者特異性 hiPSC 系，滿足疾病建模中對大樣本量的需求；③臨床轉化潛力：兼容化學定義的 E8 培養基，符合臨床級細胞生產要求，為細胞替代療法提供高質量細胞來源；④簡化實驗流程：2D 與 3D 的無縫轉換便于整合下游分化實驗，加速藥物篩選和疾病機制研究。
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隨著人類誘導多能干細胞（hiPSC）在疾病建模、藥物篩選等領域的應用，亟需標準化、自動化、低成本的 hPSC 擴增技術。
現有生物反應器多適用于大規模生產，存在體積大、需大量培養基、操作復雜、依賴專業人員等問題，難以滿足多患者特異性 hiPSC 系的平行小規模擴增需求。
因此，研究旨在開發一種適用于中規模、平行化、簡單高效的 hPSC 懸浮擴增系統。
2. 材料與方法
細胞類型：
人誘導多能干細胞（hiPSC）：iLB-C-31f-r1（源自真皮成纖維細胞）
人胚胎干細胞（hESC）：H9
培養系統：
OLS CERO臺式細胞生物反應器：含 4 個 50mL 一次性培養容器，具備溫度控制（37℃）、CO₂濃度控制、旋轉攪拌（維持聚集物懸浮及營養供應），參數可通過觸摸屏設置并保存。
培養方案：
接種：從 2D 培養收獲單細胞，以 0.33-2.0×10⁵ cells/mL 密度接種至 10mL 培養基（含 10μM ROCK 抑制劑）。
培養：每日添加 5mL 培養基（mTeSR 培養 4 天，E8 需縮短周期），通過調整旋轉速度控制聚集物大小。
傳代：聚集物沉降后離心，經 Accutase 處理為單細胞，重新接種。
檢測方法：
多能性驗證：免疫熒光（檢測 Oct-4、Nanog、Tra1-60 等）、流式細胞術（Tra1-60 表達）。
分化潛能：三胚層分化實驗（檢測 AFP、SMA、TUBB3 等標志物）、TaqMan® hPSC Scorecard™ Panel。
基因組穩定性：SNP 芯片分析。
代謝分析：葡萄糖和乳酸濃度檢測（YSI 2700 分析儀）。
3. 研究結果
3D 懸浮培養體系的建立：
在 mTeSR 中，以 7.5×10⁴ cells/mL 接種時，4 天內擴增倍數達 4.9±2.1，Tra1-60 表達 > 90%。
形成均一圓形聚集物，平均直徑 140±36μm（mTeSR）、138±24μm（E8）。
長期擴增能力（10 代）：
擴增率：hESC 為 5.42±2.87，hiPSC 為 5.09±3.20（mTeSR）；E8 中 hESC 擴增率 7.1±3.4，與 mTeSR 無顯著差異。
多能性維持：持續高表達 Tra1-60（>90%）、Oct-4、Nanog，無分化標志物表達。
基因組與分化潛能：SNP 分析證實核型穩定，三胚層分化實驗及 Scorecard 檢測顯示分化能力未受影響。
mTeSR 與 E8 培養基對比（如下表）：
| 指標 | mTeSR 培養基 | E8 培養基 |
| 最大擴增倍數 | 低接種密度下可達 20 倍 | 低接種密度下可達 14 倍 |
| Tra1-60 表達高峰 | 第 4 天（>90%） | 第 3 天（88.4±1.7%），第 4 天降至 61.8±29.3% |
| 代謝特點 | 第 4 天起葡萄糖驟降、乳酸驟升 | 第 3 天起葡萄糖驟降、乳酸驟升 |
| 培養周期 | 4 天 | 需縮短（建議 3 天） |
| 聚集物大小 | 140±36μm | 138±24μm |
2D 與 3D 培養轉換：hPSC 在 2D 與 3D 培養間切換后，仍保持典型克隆形態及高表達多能性標志物（Tra1-60>90%）。
4. 討論與意義
該系統解決了現有技術的痛點，實現了 hPSC 的中規模、平行化、低成本擴增，操作簡單且無需專業培訓。
支持從低接種密度起始，且能長期維持 hPSC 的多能性和基因組穩定性，適用于 hiPSC 生物銀行建設和疾病建模。
兼容 mTeSR（ undefined ）和 E8（化學定義、無血清）兩種培養基，其中 E8 的應用為臨床級細胞生產提供了可能。
2D 與 3D 培養的無縫轉換便于整合下游 2D 分化實驗，拓展了其在基礎研究和應用中的實用性。
關鍵問題：
該 hPSC 懸浮擴增系統相比傳統培養方法有哪些核心優勢？
答：核心優勢包括：①操作簡化：使用 OLS CERO臺式反應器，無需復雜設備或專業培訓，支持 4 個樣本平行培養；②成本與效率：可從低至 0.3×10⁵ cells/mL 的密度起始，每日僅需添加培養基（無需 80% 換液），降低試劑消耗和操作時間；③穩定性：10 代擴增后仍保持正常核型、三胚層分化潛能及多能性；④靈活性：支持 2D 與 3D 培養無縫轉換，兼容 mTeSR 和 E8 兩種培養基。
mTeSR 和 E8 培養基在該系統中應用時的主要差異是什么？
答：主要差異體現在培養周期和代謝動力學：①培養周期：mTeSR 可維持 4 天培養，Tra1-60 表達仍 > 90%；E8 中 Tra1-60 表達在第 3 天達高峰（88.4±1.7%），第 4 天顯著下降（61.8±29.3%），需縮短培養周期；②代謝：mTeSR 中葡萄糖消耗和乳酸產生從第 4 天驟升，E8 則從第 3 天開始；③擴增倍數：低接種密度下，mTeSR 最大擴增 20 倍，E8 為 14 倍，但兩者長期平均擴增率無顯著差異。
該系統對基于 hiPSC 的醫學研究有何推動作用？
答：①標準化細胞制造：提供可重復的擴增方法，減少批次差異，利于多中心研究數據比對；②支持大規模生物銀行：可平行擴增多患者特異性 hiPSC 系，滿足疾病建模中對大樣本量的需求；③臨床轉化潛力：兼容化學定義的 E8 培養基，符合臨床級細胞生產要求，為細胞替代療法提供高質量細胞來源；④簡化實驗流程：2D 與 3D 的無縫轉換便于整合下游分化實驗，加速藥物篩選和疾病機制研究。
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