犬心絲蟲（Dirofilaria immitis，HMs）單克隆抗體的制備及應用

一、犬心絲蟲抗原特性與靶抗原篩選
（一）犬心絲蟲關鍵抗原蛋白
成蟲抗原（Adult Antigen）
抗原 P（AgP）：成蟲分泌排泄抗原（ES 抗原）中的主要免疫原性蛋白，分子量約 24 kDa，與宿主免疫反應密切相關。
熱休克蛋白（HSP70/HSP90）：保守性高，參與蟲體應激反應，免疫原性強。
微絲蚴表面蛋白（MSP）：存在于微絲蚴（L1 期）表面，用于早期感染檢測。
抗原選擇依據
診斷應用：優先選擇成蟲 ES 抗原（如 AgP），因其在感染犬血清中可檢測到特異性抗體，且與其他絲蟲（如惡絲蟲）交叉反應低。

二、抗犬心絲蟲單克隆抗體（mAb）的制備流程
（一）抗原制備與動物免疫
重組抗原表達
基因克隆：從犬心絲蟲成蟲 cDNA 文庫中擴增 AgP 基因，插入 pET 系列原核表達載體，轉化 E. coli BL21 (DE3) 菌株。
蛋白表達與純化：IPTG 誘導表達后，通過 Ni-NTA 親和層析純化重組 AgP 蛋白，SDS-PAGE 驗證純度（＞95%），BCA 法測定濃度。
Balb/c 小鼠免疫方案
初次免疫：重組 AgP 蛋白（50 μg / 只）與弗氏完全佐劑乳化，腹腔注射。
加強免疫：每 2 周用弗氏不完全佐劑乳化抗原（25 μg / 只） booster，共 3 次；末次免疫前 3 天，尾靜脈注射純抗原（無佐劑）加強。
效價檢測：免疫后 7 天采集小鼠血清，間接 ELISA 檢測抗 AgP 抗體效價（≥1:10,000 視為合格）。

（二）雜交瘤細胞構建與篩選
脾細胞與骨髓瘤細胞融合
脾細胞制備：取效價最高的免疫小鼠脾臟，研磨成單細胞懸液，計數；
細胞融合：脾細胞與 SP2/0 骨髓瘤細胞按 5:1 比例混合，50% PEG1500 誘導融合，接種于 HAT 選擇性培養基，37℃、5% CO₂培養。

陽性雜交瘤細胞篩選與克隆化
初篩：融合后 10-14 天，取培養上清，以重組 AgP 蛋白為包被抗原，間接 ELISA 篩選陽性孔。
克隆化：對陽性孔細胞采用有限稀釋法（1 cell/well）克隆化，重復 3 次，直至單克隆細胞株穩定分泌抗體。

（三）單克隆抗體的制備與純化
腹水制備
預處理：6-8 周齡 Balb/c 小鼠腹腔注射降植烷（0.5 mL / 只），7 天后注射陽性雜交瘤細胞（1×10⁶ cells / 只）。
腹水收集：注射后 7-14 天，收集腹水，4℃離心（3000 rpm，10 min），取上清。

抗體純化與鑒定
亞型測定：ELISA 法確定抗體亞型（如 IgG1、IgG2a 等）；
特異性驗證：Western blot 檢測抗 AgP mAb 與犬心絲蟲成蟲提取物的結合特異性，同時驗證與其他寄生蟲（如犬蛔蟲、鉤蟲）抗原的交叉反應。
Protein G 親和層析：腹水經 0.22 μm 濾膜過濾后，上樣至 Protein G 柱，用甘氨酸 - HCl 緩沖液（pH 3.0）洗脫，立即用 1 M Tris-HCl（pH 8.0）中和，PBS 透析脫鹽。

鑒定指標：
三、抗犬心絲蟲單克隆抗體的應用
（一）免疫診斷：雙抗體夾心 ELISA 檢測犬心絲蟲抗原

實驗原理
包被抗 AgP mAb（捕獲抗體）于 96 孔板，待檢血清中的犬心絲蟲循環抗原（CAg）與捕獲抗體結合，再與生物素標記的抗 AgP mAb（檢測抗體）反應，最后通過鏈霉親和素 - HRP 顯色，OD 值判定陽性。

操作流程
包被：捕獲抗體（10 μg/mL）4℃包被過夜，5% BSA 封閉 2 h；
加樣：待檢血清（1:100 稀釋）37℃孵育 1 h，洗滌后加生物素標記抗體（1:5000），37℃孵育 1 h；
顯色：TMB 底物顯色 15 min，2 M H₂SO₄終止，酶標儀測 450 nm OD 值（cut-off 值 = 陰性對照 OD 均值 ×2.1）。

臨床價值
該方法可檢測感染后 3-4 個月的犬心絲蟲 CAg，靈敏度＞95%，特異性＞98%，優于傳統微絲蚴檢測法（需感染 6 個月后才能檢出）。

（二）免疫層析試紙條（膠體金法）的制備
試紙條設計
檢測線（T 線）：包被抗 AgP mAb（1 mg/mL）；
質控線（C 線）：包被羊抗鼠 IgG（1 mg/mL）；
結合墊：膠體金標記抗 AgP 另一表位 mAb（20 μg/mL），干燥后組裝。

檢測流程
犬血清或血漿滴加至樣品墊，若含 CAg，金標抗體與抗原結合，遷移至 T 線時被捕獲抗體識別，形成紅色條帶，C 線顯色驗證試紙條有效性。
優勢：10-15 分鐘出結果，適合現場快速篩查，與 ELISA 符合率＞90%。

（三）Western blot 檢測犬心絲蟲蛋白表達
應用場景
研究犬心絲蟲感染過程中 AgP 蛋白的表達規律，或評估藥物（如伊維菌素）對蟲體抗原表達的影響。
實驗要點
成蟲或微絲蚴裂解物經 SDS-PAGE 分離后轉膜，抗 AgP mAb（1:1000）孵育，HRP 標記羊抗鼠 IgG（1:5000）顯色，ECL 曝光后可見 24 kDa 特異性條帶。

四、單克隆抗體應用的關鍵優化與挑戰
交叉反應控制
犬心絲蟲與貓心絲蟲（D. cati）、惡絲蟲（D. repens）存在部分抗原同源性，需用這些蟲種的抗原驗證 mAb 特異性，避免誤診。

抗體穩定性改良
免疫層析用 mAb 需經耐鹽實驗（如 0.1-0.5 M NaCl）和長期保存實驗（4℃、37℃加速老化）驗證穩定性，必要時通過抗體工程改造（如定點突變）提高熱穩定性。

早期感染檢測的局限性
單克隆抗體檢測 CAg 適用于成蟲感染階段（≥3 個月），對微絲蚴期（L1）感染靈敏度較低，需結合抗微絲蚴 mAb 開發聯合檢測方法。

五、拓展應用：犬心絲蟲疫苗研發與免疫機制研究
疫苗候選抗原篩選
抗 AgP mAb 可用于篩選能誘導中和抗體的抗原表位，輔助亞單位疫苗設計（如重組 AgP 蛋白疫苗）。
蟲體 - 宿主互作研究
通過 mAb 標記 AgP 蛋白在蟲體中的定位（免疫熒光或免疫電鏡），探究其在蟲體入侵、免疫逃逸中的作用。

六、總結
抗犬心絲蟲單克隆抗體憑借高特異性和穩定性，在犬心絲蟲病的快速診斷（ELISA、免疫層析）、基礎研究（抗原表達分析）及疫苗開發中具有重要價值。通過優化抗體制備工藝和檢測方法，可進一步提升其在犬心絲蟲病防控中的應用效能，尤其適用于大規模流行病學調查和臨床早期篩查。