光片顯微鏡新進展：斜面顯微鏡實時“防焦點漂移”技術

重要發現
01光學成像中的焦點漂移問題
光片熒光顯微鏡（LSFM）作為一種先進的光學成像技術，在生物醫學領域有著廣泛的應用。其通過特定角度的光片照射樣品，并由另一方向的檢測系統收集熒光信號，從而實現對樣品的三維成像。在典型的LSFM中，照明和檢測系統分別由兩個相互垂直的物鏡實現，這就要求光片平面與檢測系統的焦平面精確重合。然而，在實際操作中，由于環境因素（如溫度變化、機械振動等），檢測物鏡可能會發生焦點漂移，導致光片與焦平面的相對位置改變，從而影響成像質量。為解決這一問題，研究人員開發了多種自動對焦算法，這些算法通常需要獲取一系列熒光圖像來估算相對位移，這不僅會消耗熒光信號，還可能中斷實際成像過程。

02斜面顯微鏡（OPM）的創新解決方案
斜面顯微鏡（OPM）是LSFM的一種變體，它使用單個物鏡以斜角發射光片，并用同一物鏡檢測熒光。在這種設計中，如果主物鏡發生漂移，光片和檢測會以相同速率漂移，從而保持相對對齊。然而，在OPM中，遠程聚焦系統可能會引入類似傳統LSFM中的成像退化問題。研究人員通過實驗驗證了在OPM中使用與熒光檢測光譜不同的激光光來穩定遠程聚焦單元，該系統無需熒光光即可獨立于熒光成像連續運行。實驗中，研究人員使用了一種特定波長的激光，通過精確的光學設計和調整，使得激光光能夠在不干擾熒光檢測的情況下用于遠程焦點的穩定。

03實驗驗證與高精度成像
通過對激光光的實時監測和反饋控制，研究人員實現了約21納米的軸向精度，并能夠在實驗室環境中維持長達數小時的穩定成像。在實驗中，研究人員展示了使用穩定OPM對黑色素瘤癌細胞的肌動蛋白骨架進行亞細胞成像的結果。這些實驗結果表明，該遠程焦點穩定技術能夠在長時間成像過程中保持光片與檢測焦平面的精確對齊，從而顯著提高成像質量，并減少因焦點漂移導致的模糊。此外，研究人員還通過長時間成像實驗驗證了該技術的穩定性，發現在啟用焦點穩定功能后，系統的軸向漂移顯著降低，成像分辨率在整個實驗過程中保持穩定。

創新與亮點
創新之處在于提出了一種無需消耗樣品熒光的遠程焦點穩定方法，專門針對斜面顯微鏡（OPM）這一特殊的光片熒光顯微鏡（LSFM）變體。該方法利用與熒光檢測光譜不同的激光光，通過獨特的光學設計，使得激光光能夠在不干擾熒光信號的情況下實現對遠程聚焦系統的實時監測和反饋控制。這種方法不僅避免了傳統光片穩定方法中因獲取熒光信號而導致的樣品光漂白和成像中斷問題，還實現了極高的軸向精度（約21納米）和長時間（數小時）的穩定成像能力，為長時間高分辨率的生物醫學成像提供了一種全新的解決方案。

總結與展望
這項研究為光片熒光顯微鏡（LSFM）領域帶來了重要的技術突破，特別是在斜面顯微鏡（OPM）的遠程焦點穩定方面取得了顯著進展。不僅為生物醫學研究中的長時間觀察提供了更可靠的技術支持，也為未來光學成像技術的發展提供了新的思路和方向。未來，通過引入更先進的光學元件和控制算法，有望進一步提高該技術的穩定性和精度。該技術也有望與其他先進的光學成像技術相結合，為生物醫學研究提供更全面、更高效的成像解決方案。

論文信息
聲明：本文僅用作學術目的。
Nguyen TD, Rahmani A, Ponjavic A, Millett-Sikking A, Fiolka R. Active Remote Focus Stabilization in Oblique Plane Microscopy. bioRxiv [Preprint]. 2024 Dec 2:2024.11.29.626121. doi: 10.1101/2024.11.29.626121. Update in: Biomed Opt Express. 2025 Feb 26;16(3):1216-1224.

DOI:10.1364/BOE.553545.