ELISA檢測技術(shù)的原理、操作流程與要點(diǎn)全解析

一、ELISA技術(shù)概述
酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）是一種基于抗原抗體特異性反應(yīng)的固相免疫檢測技術(shù)，廣泛應(yīng)用于體液中微量物質(zhì)的檢測。它起源于20世紀(jì)70年代初，由多位學(xué)者共同推動發(fā)展，如今已成為分析化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中的重要工具。

二、ELISA的核心原理
ELISA的基本原理是利用抗原與抗體之間的特異性結(jié)合，將待測物與酶連接，再通過酶催化底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)定量或定性分析。這一過程涉及抗原或抗體的固相化，以及抗原或抗體的酶標(biāo)記。在檢測過程中，受檢標(biāo)本與固相載體上的抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)，經(jīng)過洗滌分離后，加入酶標(biāo)記的抗原或抗體進(jìn)一步結(jié)合。最終，通過酶與底物反應(yīng)生成的有色產(chǎn)物的顏色深淺，反映標(biāo)本中待測物質(zhì)的含量。

三、ELISA的主要類型及操作流程
（一）雙抗體夾心法
檢測抗原：首先將特異性抗體固定在固相載體上，加入待測標(biāo)本，使標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合。隨后加入酶標(biāo)記的抗體，與固相抗原抗體復(fù)合物結(jié)合。最后加入底物顯色，通過比色分析確定抗原含量。此法適用于檢測大分子抗原，如HBeAg、HBsAg等。

檢測抗體：類似檢測抗原的操作，但使用特異性抗原包被和制備酶結(jié)合物，用于檢測相應(yīng)抗體。

（二）間接法
主要用于檢測抗體。將抗原固定在固相載體上，加入受檢血清，使血清中的特異性抗體與抗原結(jié)合。再加入酶標(biāo)記的抗抗體，與固相抗體結(jié)合。此法適用于傳染病抗體檢測，關(guān)鍵在于抗原的純度。

（三）競爭法
檢測抗體：標(biāo)本中的抗體與酶標(biāo)抗體競爭結(jié)合固相抗原，標(biāo)本中抗體越多，結(jié)合的酶標(biāo)抗體越少，顯色越淺。

檢測抗原：適用于小分子抗原或半抗原的檢測，標(biāo)本中抗原與酶標(biāo)抗原競爭結(jié)合固相抗體。

（四）捕獲法
用于檢測IgM抗體，常用于傳染病早期診斷。先用抗人IgM抗體捕獲血清中的IgM，再加入特異性抗原和酶標(biāo)抗體進(jìn)行檢測。

（五）親和素-生物素系統(tǒng)ELISA
利用親和素與生物素的高親和力，提高檢測的靈敏度和特異性。分為LAB法和ABC法，通過生物素標(biāo)記抗體或抗原，結(jié)合親和素和酶標(biāo)生物素進(jìn)行檢測。

四、ELISA的特點(diǎn)
高靈敏度：酶的催化作用放大了免疫反應(yīng)信號，可實(shí)現(xiàn)微量物質(zhì)的檢測。
強(qiáng)特異性：基于抗原抗體的高度特異性結(jié)合，確保檢測的準(zhǔn)確性。

五、ELISA實(shí)驗(yàn)材料與儀器
聚苯乙烯微量培養(yǎng)板
酶聯(lián)免疫檢測儀
辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體
包被液、稀釋液、洗滌液、封閉液
底物溶液（如鄰苯二胺）和終止液

六、ELISA操作步驟及要點(diǎn)
（一）操作步驟
包被抗原：將抗原稀釋后加入培養(yǎng)板孔中，37℃溫育1小時(shí)，4℃過夜。
洗滌：用洗滌液清洗培養(yǎng)板，去除未結(jié)合物質(zhì)。
封閉：加入封閉液，37℃孵育1小時(shí)，防止非特異性結(jié)合。
加入標(biāo)本：加入稀釋后的待測血清，37℃孵育2小時(shí)。
加入酶標(biāo)抗體：加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體，37℃孵育1小時(shí)。
顯色：加入底物溶液，室溫避光反應(yīng)10-15分鐘。
終止反應(yīng)：加入終止液，終止顯色反應(yīng)。
結(jié)果讀取：用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長讀取吸光值。

（二）操作要點(diǎn)
標(biāo)本處理：血清標(biāo)本應(yīng)避免溶血和細(xì)菌污染，可短時(shí)間4℃保存或低溫冰存。反復(fù)凍融會影響抗體效價(jià)，需分裝保存。
試劑準(zhǔn)備：嚴(yán)格按試劑盒說明準(zhǔn)備試劑，使用高質(zhì)量的蒸餾水或去離子水。
加樣：避免氣泡和交叉污染，確保加樣準(zhǔn)確。
溫育：37℃溫育1-2小時(shí)，確保抗原抗體充分反應(yīng)。
洗滌：徹底洗滌是關(guān)鍵，可采用浸泡式或流水沖洗式，確保去除未結(jié)合物質(zhì)。
顯色與比色：顯色時(shí)間需嚴(yán)格控制，比色時(shí)需校準(zhǔn)儀器，選擇合適波長。

七、結(jié)果判斷
定性檢測：通過目視或比色法判斷陽性或陰性。可采用陽性判定值法或標(biāo)本/陰性對照比值法。
定量檢測：通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法，根據(jù)吸光值確定標(biāo)本中待測物質(zhì)的濃度。

ELISA技術(shù)因其操作簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)，已成為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷中不可或缺的工具。掌握其原理和操作要點(diǎn)，可有效提高檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。

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