RAYPA培養基自動制備分裝儀在大腸菌群測定中的應用（多管發酵法）

方案摘要：大腸菌群是一群能發酵乳糖并產酸產氣，需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。本方法使用RAYPA培養基自動制備分裝儀，主要圍繞培養基的精準制備與微生物檢測的標準化需求展開。通過自動化技術確保培養基的成分、滅菌條件和使用流程符合檢測標準，從而提升大腸菌群檢測的準確性、效率和重復性。
 
方案詳情：
一、實驗原理
       多管發酵法是水中總大腸菌群檢測的常用方法，其核心原理依托于總大腸菌群的生物學特性，即能夠發酵乳糖并產酸產氣，同時具備革蘭氏染色陰性、無芽孢且呈桿狀的特點。該檢測過程通過三個步驟依次開展，最終實現對水樣中總大腸菌群數量的測定。‌多管發酵法需要分裝大量的乳糖膽鹽發酵培養液，fluidot自動液體分裝儀可以一次性裝四個試管架，循環做業。大大減輕實驗人員的工作壓力，提高實驗效率。
 
二、‌實驗準備
1、設配和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下:
① 試管。
② 小倒管。
③ 電動移液器：pipetty MSIC90-001-10mL。
④ 手動移液器：fluidot MSP1K-1ML。
⑤ 恒溫培養箱：36 ℃±1℃。
⑥ 冰箱：2 ℃~8 ℃。
⑦ pH 計或 pH 比色管或精密 pH 試紙。
⑧ RAYPA培養基自動制備分裝儀。
⑨ Fluidot自動液體分裝儀。
 
 
2、培養基和試劑
① 乳糖膽鹽發酵培養液。
② 亮綠乳糖膽鹽培養液。
③ 無菌生理鹽水。
④ 無菌磷酸鹽緩沖液。
 
三、檢驗程序
1、大腸菌群多管發酵法的檢驗程序如下：
 
 
四、實驗步驟
1、使用RAYPA培養基自動制備分裝儀，自動制備實驗所需的培養液、無菌水及緩沖液，并按實驗要求分裝到合適的容器內。
 
2、初發酵實驗 
① 使用Pipetty電動移液器吸取 10 mL 水樣接種到 10 mL 雙料乳糖膽鹽發酵培養液中，共接種5份。
② 吸取1 mL 水樣接種到 10 mL單料乳糖膽鹽發酵培養液中，共接種5份。
③ 吸取1 mL 水樣接種到9mL無菌生理鹽水或無菌磷酸鹽緩沖液中，混勻，從中吸取1 mL稀釋液到 10 mL單料乳糖膽鹽發酵培養液中，共接種5份。
④ 輕搖試管（避免小倒管中產生氣泡），使液體充分混合，置 36 ℃±1 ℃培養箱內培養 24 h±2 h。觀察每管是否產氣，如有氣體產生則為初發酵試驗陽性，如不產氣則為大腸菌群陰性。
 
3、確證實驗
① 初發酵試驗陽性管中培養液充分搖勻后，取一接種環培養液，接種到10 mL亮綠乳糖膽鹽培養液中，置 36 ℃±1 ℃培養箱中培養 48 h±2 h。
② 觀察亮綠乳糖膽鹽培養液中小倒管內的產氣情況，如有氣體產生，就可確定為大腸菌群陽性，記下產氣的陽性試管數，查表28可得出水樣中大腸菌群的MPN值；如無氣體產生則為大腸菌群陰性。
4、MPN值的計算
如水樣含菌量少，可按 100 mL、10 mL、1 mL 接種，實際 MPN 值應為表中的 MPN 值除以 10；如水樣含菌量多，可按1 mL、0.1 mL、0.01 mL接種，實際 MPN 值應為表中的 MPN 值乘以10，以此類推。
5、列舉說明
假設初發酵試驗 15 支試管中的陽性管數如下：
在接種量為 10 mL 的管中有 5 支管陽性；
在接種量為1 mL 的管中有 4 支管陽性；
在接種量為 0.1 mL的管中有2支管陽性；
作為初發酵試驗結果為 5-4-2。當把以上陽性管轉種到亮綠乳糖膽鹽培養液管里，經培養后，若確證試驗所給的結果為 5-3-1，那么査表 28，可得出每 100 mL，水樣中大腸菌群的 MPN 值為 110。接種量為1 mL，0.1 mL，0.01 mL時，MPN值為1100。
 
五、 結果與報告
根據確證試驗證實的乳糖膽鹽發酵管反應陽性管數，檢索方法對應的MPN表，報告每100 mL 樣品中大腸菌群的MPN值，以 MPN/100 mL表示。當所有接種水樣的乳糖膽鹽發酵管均為陰性反應，可報告100 mL水樣中未檢出大腸菌群。