低容量檢測系統(tǒng)難達(dá)細(xì)菌內(nèi)毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)的原因

一、系統(tǒng)測試容量規(guī)定
（一）藥典對樣品數(shù)量的硬性要求
藥典BET第1、2、3章針對不同類型測試，均明確規(guī)定最低樣品數(shù)量為12個。無論測試是在微孔板孔、反應(yīng)管，還是其他用于將樣品引入讀數(shù)儀的通道中進(jìn)行，用于BET測試的儀器容量都必須至少達(dá)到12個樣品。這一規(guī)定確保了檢測過程的規(guī)范性和結(jié)果的可靠性。

（二）FDA指導(dǎo)文件的補充規(guī)定
FDA的指導(dǎo)文件同樣強調(diào)了樣品容量的重要性，并對歸檔標(biāo)準(zhǔn)曲線的使用作出規(guī)定。存檔標(biāo)準(zhǔn)曲線是預(yù)先確定的參數(shù)組，用于確定標(biāo)準(zhǔn)線以測定內(nèi)毒素濃度。不過在使用存檔標(biāo)準(zhǔn)曲線前，測試實驗室必須證明標(biāo)準(zhǔn)曲線的一致性，且一致性需由使用者自行證明。此外，即便使用存檔標(biāo)準(zhǔn)曲線，也需保證12個樣品的容量以測試完整標(biāo)準(zhǔn)系列。

同時，測試中應(yīng)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)（陽性）對照來驗證已存檔標(biāo)準(zhǔn)曲線的有效性，同時還需包含陰性對照、樣品對照和陽性產(chǎn)品對照，且所有對照均為一式兩份。如此一來，使用已存檔標(biāo)準(zhǔn)曲線時，檢測系統(tǒng)至少要能容納八個樣品。并且，已歸檔標(biāo)準(zhǔn)曲線有效的前提是標(biāo)準(zhǔn)對照品定量結(jié)果在已知標(biāo)準(zhǔn)濃度的±25%范圍內(nèi)，這對測試重復(fù)性要求極高，實際操作中可能較難實現(xiàn)。一旦無法恢復(fù)標(biāo)準(zhǔn)對照，測試就會無效，必須重新進(jìn)行。

值得注意的是，指導(dǎo)文件僅在“常規(guī)測試”部分允許使用存檔曲線。在驗證試劑性能或進(jìn)行干擾因素測試（抑制/增強測試）時，測試必須包含完整的標(biāo)準(zhǔn)曲線，同樣至少需要12個樣品。

二、藥典內(nèi)毒素檢測的具體要求
2001年協(xié)調(diào)一致的USP、EP和JP，在內(nèi)毒素檢測章節(jié)對檢測流程提出嚴(yán)格要求。所有檢測必須設(shè)置陰性對照和一系列內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，且相關(guān)檢測步驟需重復(fù)操作。陰性對照用于驗證測試系統(tǒng)在無內(nèi)毒素干擾時不會誤判，確認(rèn)試劑無污染；標(biāo)準(zhǔn)系列至少涵蓋三種已知濃度的內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)（RSE），通過分析每種已知標(biāo)準(zhǔn)濃度引發(fā)的反應(yīng)，結(jié)合系統(tǒng)輸出的光密度或起始時間等數(shù)據(jù)，通常采用數(shù)學(xué)方法構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)線，這條標(biāo)準(zhǔn)線是量化樣品內(nèi)毒素濃度的關(guān)鍵依據(jù)，用于衡量樣品相對于標(biāo)準(zhǔn)品的內(nèi)毒素含量。

此外，無論是干擾因素檢測，還是常規(guī)檢測，每個檢測樣品都需要額外設(shè)置陽性產(chǎn)品對照（PPC）。該對照由添加到樣品中的已知濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素構(gòu)成，只有當(dāng)PPC中測得的內(nèi)毒素濃度處于已知濃度的50-200%范圍內(nèi)時，檢測結(jié)果才有效。若超出此范圍，則表明樣品對檢測過程存在干擾，檢測結(jié)果無效，需重新進(jìn)行檢測。由此可見，缺少任何一項指定對照，內(nèi)毒素檢測都無法達(dá)到藥典要求。

藥典內(nèi)毒素檢測章節(jié)介紹了三種類型的檢測，其中兩種屬于預(yù)備檢測，第三種才是正式的測試，其具體操作在“光度法的三種測試類型”標(biāo)題下詳細(xì)說明，表1對這三種類型的測試進(jìn)行了全面概述。