國產蛋白純化儀做離子交換層析實驗指南
離子交換層析實驗指南
離子交換層析（Ion Exchange Chromatography, IEX）是一種基于蛋白等電點（pI）和緩沖液 pH 之間的電荷差異，利用離子交換介質對帶正電（陽離子交換）或負電（陰離子交換）的蛋白進行分離的方法。該方法可用于蛋白純化、去除雜質、濃縮目標蛋白等。
1. 實驗原理
離子交換層析依賴于蛋白的凈電荷與固定相的相互作用：
陽離子交換層析（Cation Exchange, CEX）：固定相帶負電，結合帶正電的蛋白（pH < pI）。
常用填料：CM-Cellulose, SP-Sepharose。
常用填料：CM-Cellulose, SP-Sepharose。
陰離子交換層析（Anion Exchange, AEX）：固定相帶正電，結合帶負電的蛋白（pH > pI）。
常用填料：DEAE-Cellulose, Q-Sepharose。
在不同鹽濃度（如 NaCl 梯度）或 pH 梯度的作用下，結合的蛋白被依次洗脫，實現分離。
2. 實驗材料與設備
(1) 試劑與填料
- 離子交換填料（如 Q Sepharose Fast Flow, SP Sepharose Fast Flow）。
- 緩沖液（一般選擇 pKa 接近目標蛋白 pI 的緩沖體系）。常用緩沖液：
- Tris-HCl（pH 7.0-8.5）
- HEPES（pH 6.8-8.2）
- MES（pH 5.5-6.7）
- 洗脫鹽溶液：通常為 0-1 M NaCl 梯度洗脫，或 KCl、(NH₄)₂SO₄。
(2) 設備
層析柱（如 HiTrap Q FF 5 mL, HiTrap SP FF 5 mL）。
層析系統（Hass25 AKTA、FPLC等）。
（圖例使用輝因科技全具備自主知識產權國產蛋白純化系統Hy-Hass25）
（圖例使用輝因科技全具備自主知識產權國產蛋白純化系統Hy-Hass25）
輝因科技蛋白純化系統Hy-Hass25
紫外檢測儀（280 nm 監測蛋白洗脫）。
3. 實驗步驟
Step 1. 預處理
樣品準備：
細胞裂解、離心（10,000 x g, 10 min），取上清。
0.22 μm 過濾，去除顆粒和雜質。
調節緩沖液 pH 以確保目標蛋白帶相應電荷（pH < pI 選 CEX，pH > pI 選 AEX）。
調節離子強度，低鹽（<50 mM NaCl）可增強蛋白吸附。
柱子平衡：
用 5 倍柱體積（CV）的平衡緩沖液清洗柱子，流速 1-2 mL/min。
監測 280 nm 吸光度，確保基線穩定。
Step 2. 蛋白結合
樣品加載：
以 1 mL/min 低流速 加載蛋白（最大不超過柱體積的 10%）。
監測 280 nm，確保蛋白吸附完全（流出液 A280 降低）。
洗滌雜質：
繼續用平衡緩沖液清洗柱子，直到流出液 A280 降至基線（去除未結合蛋白）。
Step 3. 洗脫蛋白
梯度洗脫：
使用 0-1 M NaCl 線性梯度（通常 10-20 CV）。
逐步增加鹽濃度，使不同結合力的蛋白依次洗脫。
監測 280 nm，記錄蛋白洗脫峰。
等度洗脫（可選）：
直接用 0.5-1 M NaCl 緩沖液一步洗脫目標蛋白（適用于已知洗脫條件的蛋白）。
Step 4. 分段收集與后處理
收集洗脫組分：
根據 UV 吸收峰，分段收集蛋白組分。
用 SDS-PAGE 確定目標蛋白所在的洗脫組分。
緩沖液置換：
透析或超濾換至目標緩沖液（如 PBS、Tris-HCl）。
濃縮蛋白（如使用 10 kDa 超濾離心管）。
4. 優化策略
(1) 提高分辨率
降低流速（0.5-1 mL/min），減少峰擴散。
優化梯度洗脫（線性梯度 vs. 分步梯度）。
(2) 提高結合效率
選擇合適的 pH，使蛋白帶足夠電荷。
低離子強度（<50 mM NaCl）有助于蛋白結合。
(3) 目標蛋白洗脫優化
低 pH 或高 pH 改變蛋白電荷狀態，幫助洗脫。
除了 NaCl，也可嘗試 KCl 或 (NH₄)₂SO₄。
5. 結果分析
SDS-PAGE：檢測目標蛋白的純度。
UV 280 nm 吸收峰：確認目標蛋白的洗脫位置。
蛋白濃度測定（Bradford/BCA 法）：計算蛋白回收率。
6. 常見問題及解決方案
問題 可能原因 解決方案
目標蛋白未結合柱子 pH 不合適，蛋白未帶電 調整 pH 使蛋白帶電
目標蛋白流失在洗脫前 樣品鹽濃度過高 降低 NaCl 濃度 <50 mM
目標蛋白洗脫不完全 鹽濃度不夠 提高 NaCl 梯度（0-1 M）
目標蛋白變性 pH 過低或過高 選擇溫和 pH（pH 6-8）
7. 典型實驗參數
參數 設定值
柱體積 5 mL (HiTrap Q/SP)
流速 1 mL/min
平衡緩沖液 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 50 mM NaCl
洗脫方式 0-1 M NaCl 梯度洗脫 (20 CV)
收集方式 1 mL 分段收集
儀器 盡量選擇優質穩定的儀器，這樣可以去除設備因素
總結
離子交換層析是一種高效的蛋白純化方法，通過調節 pH 和鹽梯度，可獲得高純度目標蛋白。合理選擇 緩沖體系、填料和梯度洗脫方式，可顯著提高分辨率和回收率。
如果你有特定蛋白或設備的需求，可進一步優化實驗條件！
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