真空離心濃縮DNA樣本在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用研究
微量疑難檢材提取時，制定正確的純化、濃縮方案是檢驗(yàn)成功的關(guān)鍵，本研究采用真空離心濃縮技術(shù)對法醫(yī)DNA樣本進(jìn)行濃縮，提高檢驗(yàn)成功率。
Chapter. 01
實(shí)驗(yàn)過程
1、不同濃度樣品濃縮
將2800M（1ng/ μl）、007（0.05 ng/ μl）、 9947A（0.005 、0.01 、0.02 、0.04 ng/ μl）、去離子水各1份，同時在 45℃的真空離心濃縮儀中離心管管蓋開啟濃縮至干燥，再分別加入去離子水10μl ， 震蕩離心后PCR擴(kuò)增。
2、不同溫度濃縮已知濃度樣品
30 份007分成3組，每組10份，分別在30℃、45℃、60℃的真空離心濃縮儀中開蓋濃縮至干燥，再分別加入去離子水10μl，震蕩離心后PCR擴(kuò)增。
3 、現(xiàn)場物證 DNA 模板濃縮
現(xiàn)場物證DNA模板48份在45℃真空離心濃縮儀中開蓋濃縮至干燥。無明顯分型的23個樣本加入去離子水6μl；分型不全的25份樣本加入去離子水 10μl，震蕩離心后PCR擴(kuò)增。
4、擴(kuò)增和檢測
按GlobalFilerTM 試劑盒說明書操作，擴(kuò)增體系為 10μl，循環(huán)次數(shù)為 29 次，已知濃度樣品1μl擴(kuò)增，現(xiàn)場物證DNA模板6μl擴(kuò)增。使用3500型基因分析儀電泳檢測。
5 、數(shù)據(jù)分析
采用某軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。相對熒光單位（Relative Fluorescence Units ，RFU）閾值設(shè)為175，13個及以上常染色體基因座獲得明確分型的為有效分型。GeneMapper® ID-X 軟件分析后導(dǎo)出包括Yindel 、DYS391 和性別位點(diǎn)在內(nèi)的24個基因座的相關(guān)數(shù)據(jù)，使用 EXCEL 軟件計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和計(jì)數(shù)。
Chapter. 02
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
一、已知濃度樣品濃縮結(jié)果
已知濃度樣品、陰性對照未發(fā)現(xiàn)污染。2800M （1ng/ μl）、007（0.05 ng/ μl）、9947A（0.02 、0.04 ng/ μl）濃縮后均獲得正確分型。低濃度的9947A （0.005 、0.01 、0.02ng/ μl）濃縮后圖譜分型質(zhì)量改善尤其明顯， 等位基因丟失減少，峰值均衡性更佳， 峰高顯著提高，檢出正確分型的基因座數(shù)分別由7 個、 11 個、16個增加到 21個、21個、22個。
007分別在 30℃、45℃、60℃濃縮后，均獲得正確分型，但峰高有差異。不同組間平均峰高 60℃ 最大、30℃最小，同組中平均峰高的標(biāo)準(zhǔn)差45℃最 大、30℃最小。溫度越高， 濃縮干燥所需時間越短。 檢驗(yàn)結(jié)果見表 1。
二、現(xiàn)場物證 DNA 模板濃縮結(jié)果
48份現(xiàn)場物證 DNA 模板經(jīng)真空離心濃縮儀濃縮4.4倍至7.7倍后，獲得的圖譜分型峰高明顯提高。 峰值均衡性改善，判別出部分非特異性帶和假純合子，等位基因數(shù)由1334個增加到1942個，有效分 型樣本由19份增加到27份。部分樣本圖譜質(zhì)量顯著改善（見圖 1）。
Chapter. 03
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
濃縮是微量疑難檢材提取中常用的方法，目前主要有Amicon 離心超濾管 、DNA Clean & ConcentratorTM - 5 試劑盒、Microcon 100 法等等。以上濃縮均需在不同的管柱間轉(zhuǎn)移DNA模板，不可避免造成DNA損耗，同時增加了污染的概率。使用恒溫混勻儀濃縮DNA的物理濃縮法，在模板體積較大時耗時長，且DNA模板長時間直接暴露在空氣中，有環(huán)境和檢材相互污染的風(fēng)險(xiǎn)。真空離心濃縮技術(shù)是改良的物理濃縮法，其原理是利用離心力、加熱和真空作用揮發(fā)液體，達(dá)到濃縮、干燥DNA的目的。在達(dá)到固定轉(zhuǎn)速后啟動真空抽吸， 揮發(fā)的液體回收至密閉容器，有效避免樣品交叉污染和實(shí)驗(yàn)室污染。本研究中未發(fā)現(xiàn)樣品間污染。該方法可同時濃縮數(shù)十個樣品，通過去離子水量調(diào)節(jié)濃縮倍數(shù)，具有一定的簡便性和靈活性。
本研究中已知濃度樣品經(jīng)濃縮后，均獲得正確分型，圖譜質(zhì)量明顯提高，尤其是低拷貝數(shù)目（LCN） 樣品。9947A（0.005 、0.01 、0.02 ng/ μl）檢出正確 分型的基因座數(shù)量分別由 7 個、11 個、16 個增加到 21 個、21 個、22 個。不同溫度下濃縮 007 均能獲得正確分型，但峰高有差異。30℃獲得的圖譜結(jié)果最穩(wěn)定，但平均峰高最大值小于45℃、60℃的峰高平均值，濃縮效果最差，濃縮時間最長，因此不推薦使用 30℃濃縮。本研究中選用的現(xiàn)場物證DNA模板是磁珠法提取純化的，抑制物較少，濃縮前檢測均分型不全，考慮為微量 DNA 樣本。
真空離心濃縮技術(shù)有以下特點(diǎn)：
①濃縮時間相對短。45℃下，恒溫混勻儀干燥50μl液體耗時8小時以上，
真空離心濃縮技術(shù)僅需約1小時；
②濃縮和回收液體均在密閉環(huán)境中，降低實(shí)驗(yàn)室污染風(fēng)險(xiǎn)；
③操作便捷，濃縮倍數(shù)靈活，濃縮過程一管完成， DNA損耗少；
④經(jīng)濟(jì)實(shí)用。該方法僅需一臺真空離心濃縮儀，即可在現(xiàn)有的提取純化方法基礎(chǔ)上長期應(yīng)用。
綜上，真空離心濃縮技術(shù)適用于提取純化后模板體積較大、抑制物少、原檢驗(yàn)圖譜分型不理想的 DNA 樣本濃縮，可以提高微量疑難檢材的檢驗(yàn)成功率。
文章來源：中國法醫(yī)學(xué)雜志 CHIN J FORENSIC MED 2019 年第 34 卷第 5 期楊靜開，劉振平 ，金胄 ，傅新愛著
Chapter. 04
相關(guān)產(chǎn)品富睿捷離心濃縮儀 富睿捷真空離心濃縮設(shè)備可同時處理多個樣品，無需擔(dān)心交叉污染。系統(tǒng)內(nèi)程序可設(shè)定至多60個，主機(jī)配備樣品在線成像系統(tǒng)，可在運(yùn)行過程中觀察樣品濃縮狀態(tài)，并根據(jù)不同的樣品對整機(jī)的真空度進(jìn)行調(diào)節(jié)。設(shè)備采用皮拉尼真空計(jì)可實(shí)時顯示腔體內(nèi)的真空度，并保證真空度的真實(shí)性。根據(jù)不同的樣品可對整機(jī)轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)節(jié)，配備實(shí)驗(yàn)室智能互聯(lián)及遠(yuǎn)程操控系統(tǒng)及智能云端故障排查系統(tǒng)，手機(jī)app可直接操控機(jī)器對主機(jī)遠(yuǎn)程進(jìn)行腔體預(yù)熱，溫度和真空度以及轉(zhuǎn)速可實(shí)時在app顯示。
產(chǎn)品參數(shù)
冷凍型控溫范圍：-6°C-100°C
常溫型控溫范圍：室溫-100°C
控溫精度：±0.1°C
轉(zhuǎn)速范圍：400RPM-2500RPM
Chapter. 01
實(shí)驗(yàn)過程
1、不同濃度樣品濃縮
將2800M（1ng/ μl）、007（0.05 ng/ μl）、 9947A（0.005 、0.01 、0.02 、0.04 ng/ μl）、去離子水各1份，同時在 45℃的真空離心濃縮儀中離心管管蓋開啟濃縮至干燥，再分別加入去離子水10μl ， 震蕩離心后PCR擴(kuò)增。
2、不同溫度濃縮已知濃度樣品
30 份007分成3組，每組10份，分別在30℃、45℃、60℃的真空離心濃縮儀中開蓋濃縮至干燥，再分別加入去離子水10μl，震蕩離心后PCR擴(kuò)增。
3 、現(xiàn)場物證 DNA 模板濃縮
現(xiàn)場物證DNA模板48份在45℃真空離心濃縮儀中開蓋濃縮至干燥。無明顯分型的23個樣本加入去離子水6μl；分型不全的25份樣本加入去離子水 10μl，震蕩離心后PCR擴(kuò)增。
4、擴(kuò)增和檢測
按GlobalFilerTM 試劑盒說明書操作，擴(kuò)增體系為 10μl，循環(huán)次數(shù)為 29 次，已知濃度樣品1μl擴(kuò)增，現(xiàn)場物證DNA模板6μl擴(kuò)增。使用3500型基因分析儀電泳檢測。
5 、數(shù)據(jù)分析
采用某軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。相對熒光單位（Relative Fluorescence Units ，RFU）閾值設(shè)為175，13個及以上常染色體基因座獲得明確分型的為有效分型。GeneMapper® ID-X 軟件分析后導(dǎo)出包括Yindel 、DYS391 和性別位點(diǎn)在內(nèi)的24個基因座的相關(guān)數(shù)據(jù)，使用 EXCEL 軟件計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和計(jì)數(shù)。
Chapter. 02
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
一、已知濃度樣品濃縮結(jié)果
已知濃度樣品、陰性對照未發(fā)現(xiàn)污染。2800M （1ng/ μl）、007（0.05 ng/ μl）、9947A（0.02 、0.04 ng/ μl）濃縮后均獲得正確分型。低濃度的9947A （0.005 、0.01 、0.02ng/ μl）濃縮后圖譜分型質(zhì)量改善尤其明顯， 等位基因丟失減少，峰值均衡性更佳， 峰高顯著提高，檢出正確分型的基因座數(shù)分別由7 個、 11 個、16個增加到 21個、21個、22個。
007分別在 30℃、45℃、60℃濃縮后，均獲得正確分型，但峰高有差異。不同組間平均峰高 60℃ 最大、30℃最小，同組中平均峰高的標(biāo)準(zhǔn)差45℃最 大、30℃最小。溫度越高， 濃縮干燥所需時間越短。 檢驗(yàn)結(jié)果見表 1。
48份現(xiàn)場物證 DNA 模板經(jīng)真空離心濃縮儀濃縮4.4倍至7.7倍后，獲得的圖譜分型峰高明顯提高。 峰值均衡性改善，判別出部分非特異性帶和假純合子，等位基因數(shù)由1334個增加到1942個，有效分 型樣本由19份增加到27份。部分樣本圖譜質(zhì)量顯著改善（見圖 1）。
Chapter. 03
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
濃縮是微量疑難檢材提取中常用的方法，目前主要有Amicon 離心超濾管 、DNA Clean & ConcentratorTM - 5 試劑盒、Microcon 100 法等等。以上濃縮均需在不同的管柱間轉(zhuǎn)移DNA模板，不可避免造成DNA損耗，同時增加了污染的概率。使用恒溫混勻儀濃縮DNA的物理濃縮法，在模板體積較大時耗時長，且DNA模板長時間直接暴露在空氣中，有環(huán)境和檢材相互污染的風(fēng)險(xiǎn)。真空離心濃縮技術(shù)是改良的物理濃縮法，其原理是利用離心力、加熱和真空作用揮發(fā)液體，達(dá)到濃縮、干燥DNA的目的。在達(dá)到固定轉(zhuǎn)速后啟動真空抽吸， 揮發(fā)的液體回收至密閉容器，有效避免樣品交叉污染和實(shí)驗(yàn)室污染。本研究中未發(fā)現(xiàn)樣品間污染。該方法可同時濃縮數(shù)十個樣品，通過去離子水量調(diào)節(jié)濃縮倍數(shù)，具有一定的簡便性和靈活性。
本研究中已知濃度樣品經(jīng)濃縮后，均獲得正確分型，圖譜質(zhì)量明顯提高，尤其是低拷貝數(shù)目（LCN） 樣品。9947A（0.005 、0.01 、0.02 ng/ μl）檢出正確 分型的基因座數(shù)量分別由 7 個、11 個、16 個增加到 21 個、21 個、22 個。不同溫度下濃縮 007 均能獲得正確分型，但峰高有差異。30℃獲得的圖譜結(jié)果最穩(wěn)定，但平均峰高最大值小于45℃、60℃的峰高平均值，濃縮效果最差，濃縮時間最長，因此不推薦使用 30℃濃縮。本研究中選用的現(xiàn)場物證DNA模板是磁珠法提取純化的，抑制物較少，濃縮前檢測均分型不全，考慮為微量 DNA 樣本。
真空離心濃縮技術(shù)有以下特點(diǎn)：
①濃縮時間相對短。45℃下，恒溫混勻儀干燥50μl液體耗時8小時以上，
真空離心濃縮技術(shù)僅需約1小時；
②濃縮和回收液體均在密閉環(huán)境中，降低實(shí)驗(yàn)室污染風(fēng)險(xiǎn)；
③操作便捷，濃縮倍數(shù)靈活，濃縮過程一管完成， DNA損耗少；
④經(jīng)濟(jì)實(shí)用。該方法僅需一臺真空離心濃縮儀，即可在現(xiàn)有的提取純化方法基礎(chǔ)上長期應(yīng)用。
綜上，真空離心濃縮技術(shù)適用于提取純化后模板體積較大、抑制物少、原檢驗(yàn)圖譜分型不理想的 DNA 樣本濃縮，可以提高微量疑難檢材的檢驗(yàn)成功率。
文章來源：中國法醫(yī)學(xué)雜志 CHIN J FORENSIC MED 2019 年第 34 卷第 5 期楊靜開，劉振平 ，金胄 ，傅新愛著
Chapter. 04
相關(guān)產(chǎn)品富睿捷離心濃縮儀 富睿捷真空離心濃縮設(shè)備可同時處理多個樣品，無需擔(dān)心交叉污染。系統(tǒng)內(nèi)程序可設(shè)定至多60個，主機(jī)配備樣品在線成像系統(tǒng)，可在運(yùn)行過程中觀察樣品濃縮狀態(tài)，并根據(jù)不同的樣品對整機(jī)的真空度進(jìn)行調(diào)節(jié)。設(shè)備采用皮拉尼真空計(jì)可實(shí)時顯示腔體內(nèi)的真空度，并保證真空度的真實(shí)性。根據(jù)不同的樣品可對整機(jī)轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)節(jié)，配備實(shí)驗(yàn)室智能互聯(lián)及遠(yuǎn)程操控系統(tǒng)及智能云端故障排查系統(tǒng)，手機(jī)app可直接操控機(jī)器對主機(jī)遠(yuǎn)程進(jìn)行腔體預(yù)熱，溫度和真空度以及轉(zhuǎn)速可實(shí)時在app顯示。
產(chǎn)品參數(shù)
冷凍型控溫范圍：-6°C-100°C
常溫型控溫范圍：室溫-100°C
控溫精度：±0.1°C
轉(zhuǎn)速范圍：400RPM-2500RPM
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