naica®數字PCR系統在霍亂弧菌活菌絕對定量檢測的應用
導讀
毒性霍亂弧菌血清群O1和O139是導致全球霍亂流行的病原體。霍亂弧菌可在水中存活，并通過糞-口途徑傳播。提升快速準確監測環境水體中霍亂弧菌的能力是預防和控制霍亂傳播的重要戰略。傳統的平板計數法被廣泛用于霍亂弧菌的檢測，是檢測的“金標準”，但需要較長的時間和精力。因此，快速準確新檢測方法的開發是必要的。
文獻解讀：
福建省疾病預防控制中心于Frontiers in Microbiology（影響因子IF：5.2）發表了名為《Absolute quantification of viable Vibrio cholerae in seawater samples using multiplex droplet digital PCR combined with propidium monoazide》的研究論文，開發了一種新的檢測方法，將三重數字PCR（dPCR）與單氮化丙啶（PMA）處理相結合，定量檢測活霍亂弧菌O1/O139和霍亂腸毒素（ctxA）。在模擬海水樣品中評價了PMA-dPCR檢測活菌源DNA的特異性和敏感性。
應用亮點
▶ 與傳統的細菌培養方法相比，數字PCR技術更省時省力、靈敏度和特異性高、抗干擾能力強。
▶ 使用PMA結合qPCR計數VBNC狀態下的霍亂弧菌O1，在同時檢測或區分活霍亂弧菌O1和O139以及了解ctxA基因的攜帶狀態方面仍存在局限性，與之相比，使用PMA結合dPCR技術的靈敏度和特異性都更好。
文章相關結果：
dPCR檢測中，rfb O1、rfb O139和ctxA的最佳引物濃度分別為1μM，而三種探針的濃度分別為0.25、0.25和0.4μM。最佳退火溫度為58°C，以獲得最準確的結果。從PMA處理中區分活死細菌的最佳策略是在20 μM濃度下孵育15min，然后暴露于650w鹵素燈20 min。
圖例說明：不同PMA濃度處理后的死菌(A) /活菌(B) 及不同光照時間后死菌的(C) qPCR結果。ΔCt=對照組PMA-Ct值-處理實驗組的Ct值。NT：未經PMA處理的對照組
在純培養溶液中，霍亂弧菌O1、O139和ctxA的檢測限（LODs）分別為127.91 CFU/mL、120.23 CFU/mL和1.5拷貝/反應，而海水樣品中三個靶標的LODs分別為150.66 CFU/mL、147.57 CFU/mL和2拷貝/反應。
圖例說明：不同PMA濃度處理后的死菌(A) /活菌(B) 及不同光照時間后死菌的(C) qPCR結果。ΔCt=對照組PMA-Ct值-處理實驗組的Ct值。NT：未經PMA處理的對照組
在純培養溶液中，霍亂弧菌O1、O139和ctxA的檢測限（LODs）分別為127.91 CFU/mL、120.23 CFU/mL和1.5拷貝/反應，而海水樣品中三個靶標的LODs分別為150.66 CFU/mL、147.57 CFU/mL和2拷貝/反應。
圖例說明：使用三重dPCR同時檢測霍亂弧菌的兩個或三個靶點
圖例說明：采用平板計數、qPCR、PMA-qPCR和PMA-triplex dPCR定量不同比例活菌下的霍亂弧菌O1和O139
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