細胞復蘇實驗步驟及注意事項

瀏覽次數：3397　發布日期：2023-2-15　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

細胞復蘇是與細胞凍存的過程相反，是指將凍存在液氮或者-80℃冰箱中的細胞解凍之后重新培養，使細胞恢復生長。當恢復到常溫狀態時，細胞的形態結構和生化反應恢復正常水平。與細胞凍存不同，細胞復蘇過程升溫要快，防止在解凍過程中水分進入細胞，形成冰晶，影響細胞存活率。

實驗材料
基礎培養基
血清（常規為FBS/NBS）
電動移液槍
移液槍
移液管[NEST]
無冰冰盒[NEST]
T25培養瓶[NEST]
自動旋蓋機[NEST]
盒裝無菌吸頭[NEST]
100mm細胞培養皿[NEST]
15mL、50mL無菌離心管[NEST]

01 不能忘記的準備
1.記得一定要預定干冰！！！不然你細胞取出來可沒地方待了，要是液氮罐距離實驗室遠點，你的細胞可能就沒了。
2.用來轉移細胞的無冰冰盒一定要滅菌！！！當然，如果條件刻苦點的泡沫盒，也不要偷懶，無論什么裝載容器，都要提前滅菌，可以有效規避污染風險。
3.水浴鍋提前預熱至37℃。
4.培養基預熱至37℃。

02 要開始了！（敲黑板）
1.在生物樣本庫中搜尋到目標細胞,在液氮罐找到對應的細胞，放入預先準備好的無冰冰盒（容器）內。冰盒內裝有碎干冰，冰芯的鋁合金外殼協同高導熱的合金模塊，確保樣品能快速冷卻，孔之間的溫度差異小于0.1℃，能很好的維持樣品間的溫度一致性。
2.在細胞進入水浴鍋解凍前，務必將凍存管豎直立在桌面上10~20s，這樣之后，可以排空可能存在在凍存管蓋縫隙內的液氮。尤其是外旋蓋的凍存管，特別要注意！不然在水浴解凍的時候有概率會砰的一聲爆發出來！極為危險。
3.將凍存管在37℃水浴鍋內水浴解凍，因為DMSO在常溫情況下對細胞有毒副作用，若解凍時間過長，會導致細胞損傷并影響其存活率，所以一定要快，解凍過程在1~2min內完成。
4.解凍完成后，在生物安全柜內，用自動旋蓋機打開凍存管，之后在移液槍將凍存管內細胞復懸，然后將細胞懸液轉移至含有5~10ml培養基的離心管中，1000rmp離心5min（根據各自細胞的特新調整離心力和離心時間）。如果沒有培養基稀釋，在離心過程中較高濃度的DMSO會對細胞損傷，影響細胞存活率！
5.丟棄上清，里面還有DMSO和死去細胞的裂解產物，這不是我們所需要的。將剩余的細胞用培養基稀釋復懸，稀釋比例為1:10~1:15，再按照大家各自實驗需求，分裝到100mm培養皿或者T25瓶中，顯微鏡觀察細胞狀態，然后轉移至細胞培養箱中培養。