關于近期Cell雜志發表的外泌體蛋白組文章的待探討問題梳理

8月13日Cell雜志在線發表了題名“Extracellular Vesicle and Particle Biomarkers Define Multiple Human Cancers“的文章1，對426個人類腫瘤和正常樣本開展了外泌體蛋白組的研究，鑒別了腫瘤組織和癌癥患者血漿來源的外泌體特異性表達的蛋白，發現這些外泌體蛋白可以診斷癌癥并且可以區分不同類型的癌癥（圖1），為外泌體蛋白組的研究提供了強大的資源數據庫。

圖1外泌體蛋白組學

該研究對426個人類樣本和71個小鼠樣本利用超速離心的方法分離外泌體，通過LC-MS/MS進行外泌體蛋白組研究。通過質譜結果分析，在所有外泌體中平均有862個蛋白，不管是腫瘤還是正常樣本，蛋白含量最多的是人和小鼠組織外植體來源的外泌體，最少的是血漿和血清來源的外泌體（圖2a-c）。對比不同類型樣本發現除了人腫瘤細胞系上清外泌體含有的蛋白量比正常細胞系外泌體中的少之外，其他類型的腫瘤和正常樣本外泌體含有的蛋白數量并無差異（圖2d）。

圖2 MS鑒別的不同樣本來源的外泌體蛋白數量

研究者對傳統常用的11個外泌體marker進行了定性分析（圖3a）。在人類細胞系來源的外泌體中，除了CD63，其他的蛋白都出現在超過一半的樣本中。同樣在人組織外植體來源的外泌體中，CD63和TG101除外，其他的蛋白也都在超過一半的樣本中出現。但是在人血漿來源的外泌體中，僅僅只有HSPA8和CD9在超過一半的樣本中出現。在超過一半的血清來源外泌體中出現的marker，也僅只有HSPA8，Alix和CD9。這些marker在這些樣本中差異性表達也應對了這些樣本間蛋白數量的差異（圖2）。這些結果說明這些傳統的marker或許在外泌體鑒定中效果并不是很好。因此研究者在質譜結果中篩選出了13個出現在超過50%人的所有樣本中的蛋白作為外泌體新的候選marker（圖3b）。

圖3 對比分析常用和新的外泌體marker

研究者又分別分析了胰腺癌組織和癌旁組織，及肺癌組織和癌旁組織，遠端組織來源的外泌體蛋白組差異。通過某些篩選原則，研究者發現了356個胰腺癌組織高表達的蛋白（圖4a），126個肺癌組織高表達的蛋白（圖4b）。

圖4 腫瘤組織外泌體高表達的Top30蛋白

基于特定的篩選原則，研究者又發現了51個胰腺癌血漿外泌體特異表達的蛋白（圖5a），19個肺癌血漿外泌體特異性的蛋白（圖5b）。和組織來源的外泌體比對，發現癌癥患者血漿外泌體特異表達的蛋白有的來源于癌組織，有的來源于癌旁組織。還有的只在血漿外泌體中表達，這些可能來源于免疫細胞。這些結果說明癌癥是一個系統性疾病，會影響機體多個組織器官變化，共同造成癌癥特有的血漿外泌體蛋白組。

圖5 腫瘤患者血漿外泌體特異性蛋白和組織對應關系

最后研究者發現組織和血漿來源的外泌體蛋白組不僅可以區分診斷癌癥和非癌癥（圖6a,b），而且可以將不同類型的癌癥進行區分（圖6c,d）。

圖6 外泌體蛋白組可以診斷不同癌癥

這項研究系統性的分析了多種癌癥組織及血漿來源的外泌體蛋白組，為相關的研究提供了寶貴的資源性數據。作為外泌體研究領域的從業者，我們不僅看到這項研究的價值，同時我們在這也發現了幾個問題，在這里呈現給大家一起來思考：

（1） 本研究中血漿和血清樣本量從0.4-6ml不等，這樣一個較為寬泛的體積會不會對樣本間的外泌體蛋白組產生影響？其實已有研究表明了樣本起始的量是會影響外泌體蛋白的檢測效果2。

（2） 為什么血漿和血清來源的外泌體中蛋白含量很少？是不是和樣本起始量有關？本研究利用5微克血漿和血清外泌體蛋白進行質譜分析，這樣少量的總蛋白是不是也是導致鑒定蛋白數量少的原因？另外改變分離方法是不是可以增加外泌體的總蛋白量，例如qEV方法比超速離心得到的外泌體總蛋白量要高。

（3） 在樣本間外泌體蛋白數量不一致的情況下，在所有樣本間對外泌體marker進行定性分析是不是合理？例如新的候選marker，FN1，在胰腺癌組織和癌旁組織間對比，特異性表達在癌組織外泌體，癌旁組織外泌體中極少表達（圖4）。

（4） 不同癌組織樣本間的數量差異很大，有的癌組織樣本只有1例（圖9），這會不會影響診斷癌癥的外泌體蛋白篩選（圖6a,b）。

圖9

（5） 本研究篩選出了血漿外泌體中大量的免疫球蛋白可以診斷癌癥。其實有研究表明了血漿中的IgG主要和外泌體富集在一起3，免疫球蛋白可以和外泌體表明攜帶的抗原結合4。那么我們在分析外泌體蛋白組數據時，什么情況下將免疫球蛋白作為高豐度蛋白剔除，在什么情況不剔除？

（6） 本研究在確定血漿外泌體蛋白來源時，是和體外培養的組織上清中分離的外泌體蛋白組進行比對。任何組織在體內環境中都可能與其他組織或器官形成互動，體外培養的組織再分泌的外泌體是否能夠體現這種互動性？是否通過與膠原酶等消化組織獲得的組織間隙外泌體比對，才更能代表組織在機體環境中分泌外泌體的真實情況？

在這樣一個學術百家爭鳴的時代，華盈生物作為多年從事外泌體研究和科研服務的標桿企業，我們珍視每一次重要科學成果的發布對整個領域帶來的啟發，我們更希望通過與所有從業者的互動和交流，為解決外泌體研究中目前面臨的種種問題提供思路和方案。當然，華盈生物也是在不斷實踐中探索前行，我們建立了穩定的外泌體蛋白組技術服務平臺，希望能夠通過與業內人士進行廣泛地合作， 揭開外泌體蛋白組研究的一個個謎團。

圖7 華盈生物外泌體蛋白標志物研發服務平臺

|   相關文獻

1. Ayuko Hoshino, Han Sang Kim, Linda Bojmar et al., Extracellular Vesicle and Particle Biomarkers Define Multiple Human Cancers. [J]. Cell, 2020;S0092-8674(20) 30874-6.  

2. Josselin Caradec, Geetanjali Kharmate, Elham Hosseini-Beheshti et al., Reproducibility and efficiency of serum-derived exosome extraction methods. [J]. Clin Biochem. 2014;47(13-14):1286-1292. 

3. Chao Huang, Kiera P Fisher, Sandra S Hammer et al., Plasma Exosomes Contribute to Microvascular Damage in Diabetic Retinopathy by Activating the Classical Complement Pathway. [J]. Diabetes. 2018;67(8):1639-1649. 

4. Michela Capello, Jody V Vykoukal, Hiroyuki Katayama et al., Exosomes harbor B cell targets in pancreatic adenocarcinoma and exert decoy function against complement-mediated cytotoxicity. [J]. Nat Commun. 2019;10(1):254.