小鼠基礎(chǔ)知識九：認識四環(huán)素誘導(dǎo)型Cre-lox系統(tǒng)

在上一講中，J博士介紹了依賴tamoxifen誘導(dǎo)型CreER重組酶系統(tǒng)，它能夠幫助我們實現(xiàn)空間與時間雙重特異性調(diào)控基因的目的。

內(nèi)容回顧：小鼠基礎(chǔ)知識八｜J博士進階教學(xué)，Tamoxifen誘導(dǎo)型cre

今天，J博士帶領(lǐng)大家學(xué)習(xí)另外一種可逆的四環(huán)素誘導(dǎo)型Cre-lox系統(tǒng)，又可被稱為Tet on/off系統(tǒng)。

本篇內(nèi)容重點：

● 什么是Tet on/off 系統(tǒng)

● 小鼠中如何應(yīng)用Tet on/off系統(tǒng)

● Tet on/off誘導(dǎo)系統(tǒng)優(yōu)點和常用品系

● Dox給藥方式

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01

什么是Tet on/off系統(tǒng)

四環(huán)素（Tetracycline,Tet）誘導(dǎo)系統(tǒng)是由E.coli大腸桿菌中Tn10轉(zhuǎn)座子改造而來，可依賴四環(huán)素進行可逆地調(diào)控基因表達。

如下圖所示，該系統(tǒng)在大腸桿菌中由四環(huán)素阻遏蛋白（Tet repressor, TetR）和Tet操縱子（Tet operator, TetO）組成。

● 在缺乏四環(huán)素(Tc)或其衍生物強力霉素（dox）的情況下，TetR二聚體與TetO結(jié)合，阻斷基因表達（左圖）。

● 當Tc或dox與TetR結(jié)合時，誘導(dǎo)TetR構(gòu)象變化，導(dǎo)致其與TetO分離并促進基因表達（右圖）。

四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)原理^[1]

利用TetR阻遏蛋白和TetO DNA元件可以在依賴Dox作用下進行可逆結(jié)合的原理，研究者開發(fā)出適用于真核生物的調(diào)控系統(tǒng)。將TetR與單純皰疹病毒（HSV）VP16蛋白轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域融合使其起到增強子的功能。并將TetO改造為弱啟動子，只有與TetR增強子相結(jié)合才可調(diào)控下游基因表達的正常表達。

如下圖所示：TetR被改造為存在Dox的情況下，分別起到結(jié)合或不接合TetO兩種效果，即Tet on/off系統(tǒng)。

● Tet on系統(tǒng)中，tetR被改為rtTA，在Dox存在條件下，可以與tetO結(jié)合開啟下游基因表達，因此為Tet on系統(tǒng)；

● Tet off系統(tǒng)中，tetR被改造為tTA，其與Dox結(jié)合后從TetO元件上解離下來，關(guān)閉基因表達，因此為Tet off系統(tǒng)。

02 小鼠中如何應(yīng)用Tet on/off系統(tǒng)

以Tet on為例，在小鼠中通常將rtTA元件和tetO元件分別構(gòu)建在不同的小鼠品系當中，而rtTA可以在不同的啟動子下驅(qū)動，以達到特異性組織誘導(dǎo)的功能。兩個小鼠品系配繁的后代，即可通過Dox給藥或去藥，達到在特異組織中可逆調(diào)控基因表達的目的。

此外，Tet on/off系統(tǒng)還可以與cre-lox系統(tǒng)聯(lián)合使用，利用強大的cre工具小鼠庫，不需要重新構(gòu)建rtTA/tTA小鼠即可實現(xiàn)在廣泛的組織中進行可逆調(diào)控基因表達。

比如：我們先利用Pdx1-cre小鼠和帶有LSL元件的rtTA floxed小鼠配繁，使其后代在胰腺表達rtTA蛋白。再將這個小鼠與攜帶tetO元件的Kras*G12D小鼠配繁，其后代小鼠就可以在Dox誘導(dǎo)下調(diào)控Kras*G12D蛋白的表達了。

03 Tet on/off誘導(dǎo)系統(tǒng)優(yōu)點和常見品系

● 精準性：藥物劑量及誘導(dǎo)時間可控，無內(nèi)源干擾

● 可逆性：去除Dox后系統(tǒng)即關(guān)閉，并可反復(fù)多次誘導(dǎo)

● 靈敏性：低劑量，即可獲得高效率結(jié)果

● 便捷性：使用食物或飲水給藥，即可取得良好效果

04  Dox給藥方式

● 飲水 ：用水制成100倍的Dox 20 mg/mL的儲備溶液。在小鼠設(shè)施中，配置成最終濃度為200微克/毫升的溶液。最好使用琥珀色的水瓶，因為Dox對光敏感。

● 飲食：食物中的Dox可由飼料公司進行定制，每kg飼料中加入200 mg Dox。在食物中可以添加食用色素，有助于追蹤哪些小鼠在服用DOX。

● 腹腔注射：10 mg Dox在0.5mL水中可以作為一次IP注射，僅針對病重的小鼠(如無法自主飲食的小鼠)。

需要注意的是，不同基因工程小鼠對于Dox的響應(yīng)是有區(qū)別的，最好還是參考所關(guān)心的小鼠品系的相關(guān)文獻，并且在開展自己的實驗前，根據(jù)實驗?zāi)康倪M行條件摸索。

參考文獻：

[1] van Til NP, Markusic DM, van der Rijt R, Kunne C, Hiralall JK, Vreeling H, Frederiks WM, Oude-Elferink RP, Seppen J. Kupffer cells and not liver sinusoidal endothelial cells prevent lentiviral transduction of hepatocytes. Mol Ther. 2005 Jan;11(1):26-34.