WB/ELISA/IHC/FC實驗指南：如何選擇合適的對照劑和封閉劑？
你是否遇到過以下幾種難題，IHC實驗結果不準確，背景高；多標記免疫組化實驗中一抗種屬來源相同時，不知該如何進行實驗；IP/Co-IP后的WB實驗出現非特異性條帶；流式實驗中沒有合適的直標一抗......你是否知道通過選擇正確的對照劑和封閉劑，可以幫助你解決這些實驗中遇到的難題，且更容易獲得準確的實驗結果。本文將給大家帶來流式細胞實驗、WB、ELISA、IHC幾大實驗中常見的問題，及解決辦法。
流式細胞實驗（Flow Cytometry）
| 可能遇到的問題 | 解決辦法 | 適用試劑 |
| 因抗體與樣本中的Fc受體相結合而產生不需要的背景 | 對Fc受體進行封閉 | 標準封閉血清（血清應與標記的抗體種屬來源一致） |
| 使用F（ab'）2形式的二抗來防止二抗與Fc受體的結合 | F（ab'）2形式的二抗 | |
| 如何確認一抗與抗原是特異性結合 | 使用同型對照抗體*作為陰性對照，用于顯示一抗有進行特異性結合 *同型對照抗體指的是一種和一抗來源相同的沒有特異性的IgG蛋白 |
ChromPure™ 純化蛋白 |
| 如何確認二抗產生的是目的信號 | 使用同型對照抗體*作為陰性對照，用于顯示二抗有進行特異性結合 *同型對照抗體指的是一種和一抗來源相同的沒有特異性的IgG蛋白 |
ChromPure™ 純化蛋白 |
| 在沒有直標一抗的條件下想要加快實驗進度 | 在孵育樣本之前使用Fab片段抗體先與一抗孵育 | FabuLight™ Fab片段抗體 |
Western Blotting實驗
| 可能遇到的問題 | 解決辦法 | 適用試劑 |
| 出現非特異性條帶 | 在用一抗孵育前，使用適當的阻斷試劑阻斷膜 | 標準血清（5%v/v）（血清應與標記的抗體種屬來源一致），或BSA（5%w/v）（不含IgG蛋白和蛋白酶） |
| 如果使用來自山羊、馬或綿羊的一級抗體，則避免使用牛奶或牛血清白蛋白。牛的IgG可能與抗體相互作用，這是由于近緣種的同源表位。 | 標準血清（5%v/v）（血清應與標記的抗體種屬來源一致） | |
| IP后WB實驗時，目標蛋白分子量位于25kDa或25kDa附近時，想要消除來自IP實驗的抗體干擾 | 為了避免檢測到50 kDa的抗體重鏈，使用抗輕鏈特異性的二抗。 | 抗輕鏈特異性的二抗 |
| 為了避免檢測到25 kDa的抗體輕鏈，使用單價Fab片段進行阻斷后，使用抗IgG且抗Fc端特異性的二抗。 | 抗Fc端特異性的二抗+Fab片段二抗（FabuLight™） |
ELISA實驗
| 可能遇到的問題 | 解決辦法 | 適用試劑 |
| 高背景 | 在與一抗孵育之前，使用適量封閉試劑進行完全封閉 | 標準血清（5%v/v）（血清應與標記的抗體種屬來源一致），或BSA（5%w/v）（不含IgG蛋白和蛋白酶） |
| 無信號 | 使用陽性對照證明帶標記二抗的活性，并在孵育了一抗同型對照后直接用二抗來檢測 | ChromPure™純化蛋白 |
關于使用牛血清白蛋白(BSA)和牛奶作為封閉劑的Tips：
BSA和dry milk有時含有牛的IgG。除了Jackson提供的牛來源抗山羊IgG的二抗外，許多其他的如抗牛、抗山羊和抗綿羊的二抗都會與牛的IgG發生反應。因此，使用BSA或dry milk進行阻斷或稀釋會顯著增加背景并降低抗體效價。使用與二抗種屬來源一致的標準血清(5% v/v)來進行阻斷是更好的選擇。
免疫組化實驗
| 可能遇到的問題 | 解決辦法 | 適用試劑 |
| 如何確認一抗與抗原是特異性結合 | 使用同型陰性對照(與一抗物種相同的非特異性IgG)來證明一抗與抗原的特異性結合 | ChromPure™純化蛋白 |
| 高背景（General） | 將可能會與其他試劑結合的內源性結合位點都封閉起來 | 標準血清（血清應與標記的抗體種屬來源一致） |
| 在沒有載體蛋白的緩沖液中稀釋抗體，并將該混合液離心以剝離沉淀物 | 如PBS/Tween 20等緩沖液 | |
| 因識別同源性免疫球蛋白而產生高背景 | 使用經過預吸附處理的二抗來減少細胞或組織樣本中相關物種之間的交叉反應 | 經過預吸附，最大程度消除物種間交叉反應的二抗 |
| 封閉內源性免疫球蛋白 | Fab片段二抗 | |
| 多標免疫組化實驗時一抗種屬來源相同 | 根據protocol使用Fab片段二抗來完成多標實驗 | Fab片段二抗 |
| 在孵育前先對一抗進行免疫標記 | FabuLight™ | |
| 內源性酶 | 使用過氧化物封閉內源性過氧化酶 | 過氧化物 |
| 使用levamisole封閉內源性磷酸酶 | levamisole | |
| 內源性生物素 | 封閉內源性生物素 | 使用streptavidin（鏈霉親和素）孵育，以消除內源性生物素 |
| 離子作用或疏水作用 | 在緩沖液中加入合適的試劑，優化鹽濃度和pH值 | Tween 20 或/和Triton X-100 |
免疫試劑
上文中提到的能夠幫助解決實驗里出現的問題的免疫試劑介紹如下：
· 標準血清（Normal Serums）
標準血清來自未產生免疫反應的動物，因此不會檢測到任何特異性抗原。在PBS(或類似的緩沖液)中稀釋到5% (v/v)的標準血清被強烈推薦作為阻斷劑，以減少非特異性、保守序列和/或fc受體結合的背景。最好的結果是使用稀釋的來自同一宿主的正常血清作為標記抗體，在加入一抗之前作為單獨的孵育步驟。
相關產品推薦：
| 產品 | 貨號 | 規格 |
| 胎牛血清(標準級) | abs974 | 25ml/125ml/500ml |
| 馬血清（標準級） | abs990 | 125ml/500ml |
| 驢血清 | abs935 | 50ml |
· 從標準血清中提取的ChromPure™純化蛋白（ChromPure™ Purified Proteins from Normal Serums）
ChromPure™蛋白主要用作一抗或二抗的實驗對照。它們也可用作Western blotting, IHC和IF的阻斷試劑。ChromPure™蛋白來源于未免疫動物的血清，不識別任何已知的抗原。它們是使用各種色譜技術制備的，以產生無污染分子觀察到的濃度高達20 mg/ml的材料，使它們成為最敏感的測定的實驗對照的理想選擇。ChromPure™蛋白可用于許多物種的各種格式，包括全免疫球蛋白，F(ab’)2和Fab片段。
人IgM、血清IgA和其他蛋白質也可用。Jackson為該產品線提供了廣泛的偶聯物，包括一系列熒光染料和示蹤酶，允許從非特異性相互作用中分辨出信號。
相關產品推薦：
| 產品 | 貨號 | 規格 |
| ChromPure Mouse IgG, whole molecule | 015-000-003 | 5mg |
| ChromPure Bovine IgG, whole molecule | 001-000-003 | 10mg |
| ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | 011-000-003 | 10mg |
· 單價Fab片段親和純化抗體
親和純化抗體fab片段可用于阻斷內源性免疫球蛋白以減少背景染色和雙標記來自同一宿主物種的主抗體。下面的例子展示了在小鼠組織上使用小鼠一抗時，如何使用Fab片段阻斷內源性免疫球蛋白。
相關產品推薦：
| 貨號 | 產品名 | 規格 |
| 115-007-003 | AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | 1mg |
| 315-007-003 | AffiniPure Fab Fragment Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L) | 1mg |
· 牛血清蛋白（無IgG，無蛋白酶）
牛血清白蛋白(BSA)被廣泛用作稀釋抗體的載體蛋白，并在免疫測定和免疫檢測方案中作為一種常用的蛋白質阻斷劑。如果牛血清蛋白是您的試驗所需的稀釋劑或阻斷劑，那么使用適合此目的的牛血清蛋白是很重要的。
牛IgG與山羊、綿羊和馬的IgG有許多共同的表位，可以成為針對這些物種的二抗的靶點(牛抗山羊IgG除外)。這也可能發生在與牛IgG有交叉反應的其他抗體上。這些相互作用可能導致抗體活性的損失和/或背景增加。這些背景的產生可能來自于粘稠可溶性免疫復合物，或來自于因牛IgG蛋白的污染而產生的非特異性交叉反應。
