GX-274 ASPEC固相萃取系統應用：從小麥中提取脫氧雪腐鐮刀菌烯醇
小麥 是世界上主要的谷類作物之一，其制成的面粉廣泛應用于食品行業。小麥及其制品受多種微生物的影響，特別是能產生真菌毒素的產毒真菌。測定小麥及其制品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol-DON)的含量對公眾健康至關重要。
脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON） （3α，7α，15-三羥基-12，13-環氧單端孢霉-9-烯-8-酮）（圖 1）是一種屬于單端孢霉烯族的真菌毒素，由鐮刀菌屬真菌產生，也稱為嘔吐毒素。其主要存在于小麥和大米等谷物中。DON在高溫下穩定，因此可在加工過程中存留，從而污染小麥及其制品。事實上，亞洲已經報告了幾起與 DON 污染相關的急性病暴發。人類攝入受 DON 污染的食物會出現惡心、嘔吐、眩暈、胃腸道紊亂和腹瀉等癥狀。此外，體外研究表明， DON還可能具有潛在遺傳毒性¹。
圖1 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的化學結構，CAS nº 51481-10-8
2017年2月8日，巴西制定了RDC No.138法規，規定脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在包括小麥、全麥面粉、意大利面、餅干等一些產品中的最大限量。全麥和全麥面粉中，DON的最大限量為1250μg/kg。²
食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定包括以下步驟：提取、凈化、洗脫和色譜定量。在本應用中 ，待測物的凈化和洗脫步驟通過 GX-274 ASPEC®全自動固相萃取系統自動化完成。通過分析方法驗證， 確保結果的可靠性。對照樣品的使用對于儀器的準確度評估至關重要。³ 在本應用中使用小麥對照樣品 B-MYC0856 對 GX-274 ASPEC®系統的準確度、精確度（可重復性和中間精密度）、檢測限及定量限的驗證。
材料和方法
樣品
對照樣品B‑MYC0856天然污染的小麥粉，DON標準值含量為877μg/kg±23 μg/kg，購自LGCStandards（Wesel, Germany）。
主要儀器與試劑
• Gilson GX-274 ASPEC®全自動固相萃取系統 (Gilson, Inc.; Middleton, WI, USA)
色譜純甲醇和乙腈購自Merck，Darmstadt，Germany。DON（D0156）購自Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA 。
• DonStar™ R 免 疫 親 和 柱 (PN COIAC5004).
(Romer Labs；Union,MO,USA)
• C18 反相分析柱(PN R0086200C5), MicrosorbMV 100-5, 250 x 4.6 mm, 5 μm.(Varian Medical Systems; Walnut Creek, CA)
• C18反相保護柱，ZORBAX, 4x3 mm.(Agilent Technologies；Palo Alto,CA,USA)
色譜分析條件：
Alliance 2695 HPLC 系統
• 流動相：水:甲醇:乙腈 (80:15:5; v/v/v)
• 流速：0.7 mL/min
• 柱溫：30°C
• 進樣量：50 μL
• 檢測：220nm 紫外波長
方法
在12.5g樣品中加入100 mL去離子水(電阻率18 MΩ.cm)， 置于水平搖床上以 200 rpm 的速度振蕩30分鐘。然后將樣品轉移到聚丙烯(PP)離心管中，3000 rpm離心10分鐘。上清液通過超細纖維濾紙過濾，濾液收集于10mL試管中，轉移至 GX-274 ASPEC®全自動固相萃取系統進行凈化。DonStar™ R免疫親和萃取柱已事先用 Gilson 3mL柱蓋密封。在Gilson TRILUTION® LH 軟件控制下，GX-274 ASPEC®全自動固相萃取系統上的樣品前處理分為兩個步驟：凈化和洗脫（圖2）。
圖2 TRILUTION®LH 軟件中樣品前處理步驟：樣品的凈化和 DON 的洗脫
自動化樣品制備總結
步驟 1：樣品凈化
• 將2 mL濾液添加至免疫親和柱上，流速 0.5mL/min。
• 用10 mL超純水清洗免疫親和柱，流速 2mL/min，清洗兩次。
• 因實驗室中的氮氣源壓力低， 從Gilson GX-274 ASPEC®全自動固相萃取系統中取出免疫親和柱。放入濃縮儀中以1400 轉/分的速度離心干燥5分鐘。
步驟 2：洗脫
• 將免疫親和柱重新放回于Gilson GX-274 ASPEC®全自動固相萃取系統。用 2mL甲醇洗脫DON，流速0.5 mL/min。洗脫液收集于5mL試管中。
從Gilson GX-274 ASPEC®全自動固相萃取系統中取出試管并置于45°C水浴中。在氮氣流下，蒸發至干燥。將蒸干的提取物溶解在1.0 mL水中，渦旋，隨后用0.45 μm PTFE膜過濾。收集濾液用于進一步的液相色譜分析。通過外標法對 DON進行定量。
結果與討論
在本應用中，我們報道了從小麥樣品中自動化分離DON的樣品制備方法。使用 GX-274 ASPEC®全自動固相萃取系統自動化樣品前處理和洗脫步驟，使用 HPLC 法檢測DON。HPLC檢測結果表明，使用免疫親和柱進行凈化可以有效去除基質背景（圖 3）。根據巴西國家計量、標準化和工業質量研究所的建議，我們對準確度、精確度、檢測限和定量限等參數進行了驗證。³
圖3 高效液相色譜-紫外檢測小麥樣品中 DON 的含量(λ = 220 nm, DON 的保留時間：10.1 min)。
檢測限和定量限約分別為信噪比（S/N）的3和10倍（表1）。定量限與校準曲線的第一點匹配（圖 4）。
表1 LC/MS 分析條件
圖4 校準曲線(濃度范圍 50-1000 ng/mL，對應最終樣品濃度 200-4000 μg/kg)
通過回收率試驗評估了該方法的準確度。在單一濃度水平下對對照樣品進行六次重復檢測，計算 DON 的平均濃度、標準偏差和變異系數。測得 DON 的回收率在 99.5%至 104.9%之間，可計算出平均回收率為102.0%，表明該方法具有良好的準確度（表 2）。
表2 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON） 的回收率
精確度是指在確定條件下，對同一樣品進行獨立和重復測量所得結果的離散度。它通常用標準偏差或變異系數數值表示。精確度的測量要求在相同的測量程序、相同的測量人員和相同參數下的相同儀器進行。對照樣品在同一天進行了六次檢測。DON測定的濃度平均值、標準偏差和變異系數見表3。這些數據表明該方法具有良好的重復性。中間精密度由兩名檢測人員在不同的兩天內對同一樣品進行六次檢測來評估。同日和不同日的變異系數均在 3%以下(表3)。對結果進行方差分析，同一實驗室不同檢測人員不同日的結果差異不顯著。
表 3 對照樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON） 濃度的測定以檢測精確度
總結及應用優勢
將小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）提取的步驟自動化能夠精確控制上樣體積和流速。變異系數低于3%，確保了不同批次樣品結果的一致性。平均回收率為102%，證明了該方法的準確性。
該方法符合巴西現行立法。可以輕易地將一個手動操作步驟融入到自動化過程中，以滿足實驗室要求。在同一應用中，TRILUTION®LH 軟件可以兼顧順序和批量需求，以提高可重復性。GX-274 ASPEC®全自動固相萃取系統能夠同時處理 4 個樣品，提高效率和通量。
訂貨信息
*其他附屬配件請咨詢 Gilson 授權銷售人員。
參考文獻：
1. Almeida, A.P., Lamardo, L.C., Shundo, L., Silva, S.A.,Navas, S.A., Alaburda, J., Ruvieri, V., Sabino, M.Occurrence of deoxynivalenol in wheat flour, instant noodle and biscuits commercialized in Brazil. Food Addit. Contam. Part B Surveill., 9, 251-255 (2016).
2.Resolução RDC No. 138 de 8 de fevereiro de 2017. Altera a Resolução da Diretoria Colegiada – RDC No.7, de 18 de fevereiro de 2011, que dispõe sobre limites máximos tolerados (LMT) para micotoxinas em alimentos, para alterar os LMT da micotoxina deoxinivalenol (DON) em trigo e produtos de trigo prontos para oferta ao consumidor e os prazos para suaaplicação.
http://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/anvisa/2017/rdc0138_08_02_2017.pdf
3.Orientação sobre Validação de Métodos de Ensaios Químicos (Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial, 2011).
4.Vocabulário Internacional de Metrologia, Conceitos fundamentais e gerais de termos associados (Instituto Português da Qualidade, 2012).
