超氧化物岐化酶(SOD)的應用方案

超氧化物岐化酶(SOD)的應用方案(三氮藍四唑NBT法測定)
引言：
SOD是含金屬輔基的酶。高等植物含有兩種類型的SOD:Mn-SOD和Cu.Zn-SOD，它們都催化下列反應:由于超氧自由基(02)為不穩定自由基，壽命極短，測定SOD活性一般為間接方法。并利用各種呈色反應來測定SOD的活力。核黃素在有氧條件下能產生超氧自由基負離子02-..-，當加入NBT后，在光照條件下，與超氧自由基反應生成單甲躦(黃色)，繼而還原生成二甲躦，它是一種藍色物質，在560nm波長下有最大吸收。當加入SOD時，可以使超氧自由基與H結合生成H2O2和02，從而抑制了NBT光還原的進行，使藍色二甲攢生成速度減慢。通過在反應液中加入不同量的SOD酶液，光照--定時間后測定560nm波長下各液光密度值，抑制NBT光還原相對百分率與酶活性在一定范圍內呈正比。反應液藍色愈深，說明酶活性愈低。
儀器及試劑
美析UL-1000超微量紫外可見分光光度計
離心機
0.05mol/L 磷酸緩沖液(PBS，pH7.8):
A母液: 0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液:取Na2HPO4 12H20(分子量358.14)71.7g; B 母液: 0.2mol/L 磷酸二氫鈉溶液:取NaH2PO4 12H2O (分子量156.01) 31.2g。分 別用蒸餾水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS ( pH7.8)的配制:分別取A母液(Na2HPO4) 228.75ml,
B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸餾水定容至1000ml。
14.5mM甲硫氨酸溶液:稱取1.0818g Met用磷酸緩沖液(pH7.8)定容至500ml。
3mM EDTA-Na2溶液:稱取0.1117g EDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至100ml。
60μM核黃素溶液:稱取0.0023g核黃素用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存。
2.25mM氮藍四唑(NBT)溶液:稱取0.092g NBT用PBS定容至50ml,避光保存。
實驗步驟
1.酶液提取
稱取0.5g (可視情況調整)樣品(新鮮葉片或根系)洗凈后置于預冷的研缽中，分三次加入10ml 50mmol/L預冷的磷酸緩沖液(pH7.8) 在冰浴上研磨成勻漿，轉入離心管中在4C、12000g 下離心20min，.上清液即為SOD粗提液。
2.酶活性測定
(1)反應混合液配制(以60個樣為準):分別取配好的Met溶液162ml,.EDTA-Na2溶液6ml，NBT 溶液6ml，核黃素溶液6ml,混合后充分搖勻;
(2)分別取2.9ml反應混合液和0.1ml (可視情況調整)酶液于指形管中此即反應管;同時做兩支對照管，其中1支試管加2.9ml反應混合液和0.1ml PBS (不加酶液)作為最大光還原管，另1支加2.9ml反應混合液和0.1mlPBS同時用錫箔紙包好遮光用于測定時調零。
(3)將試管置于光照培養箱中在4000lux光照25°C下反應20min;
(4)反應結束后以不照光的對照管調零，分別測定各管在560nm下的吸光度(OD560 )
計算結果
已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一-個酶活單位(U),
按下式計算活性n=[(ODmax 0D560)/0Dmax]/2
SOD總活性= [( Ack-AE)XV]/ (1/2AckXWXVt)
SOD比活力=SOD總活性/蛋白質含量
SOD總活性以鮮重酶單位每克表示(u/gFW);比活力單位以酶單位每:毫克蛋白表示;
 Ack 為照光對照管的吸光度;
AE 為樣品管的吸光度;
 V為樣品液總體積(ml);
Vt 為測定時的酶液用量(ml); W為樣品鮮重(g);
蛋白質含量單位為mg/g。
注意事項
1.酶液提取須在4℃下進行，提取后立即進行測定，冰箱中放幾小時活性也會下降;
2.植物中的酚類物質對測定有干擾，制備粗酶液時可加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或pvpp等，盡可能除去植物組織中的酚類等次生物質。
3.NBT反應液配好后過濾除去不溶物立即使用，若置于冰箱中要避光保存，充分搖勻然后使用。
4.加反應液時最好在暗光下進行;
5.核黃素產生02，NBT還原為藍甲躦都與光照密切相關，照光強度和時間要嚴格控制。光照培養箱內壁裱糊錫箔紙，使箱內均勻光照約達40μ molms，同時使照光時間一一樣，選擇試管盡量- -致，照光結束后測-一個拿一個(最好晚.上做) (溫度高時照光時間縮短，溫度低時延長);
6.測定活性時加入的酶量，以能抑制反應的50%為佳。(一個酶單位相當于引起反應液達到半抑制時酶的用量,即以能抑制反應50%的酶量為一個SOD酶活性單位。)(反應液中加酶液與PBS調零差異不大，反應液調零與其它兩個則有一定差異。)
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