naica®數字PCR系統在霍亂弧菌復制關鍵基因定量檢測驗證的應用

導讀

霍亂弧菌是人類霍亂的病原體，霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表現為劇烈的嘔吐，腹瀉，失水，死亡率甚高，屬于國際檢疫傳染病。了解霍亂弧菌的復制原理能夠幫助人們更系統的探索其感染機制。

法國巴斯德研究所及華沙大學細菌遺傳學系的科學家們在國際知名雜志Nucleic Acids Research上發表了一篇學術論文，揭示了霍亂弧菌的復制機制。（IF=16.971）

應用亮點：

▶  揭示了霍亂弧菌的兩條染色體的復制協調機制。

▶ 通過naica®微滴芯片式數字PCR系統對霍亂弧菌復制的關鍵調控基因進行定量檢測并驗證猜想。

▶  該研究發現的霍亂弧菌復制機制可能存在于所有弧菌科物種中，對于其他弧菌復制研究具有參考意義。

研究背景：

霍亂弧菌是引起霍亂的病原菌，它由兩條染色體（Chr1、Chr2）以精心編排的順序進行復制。研究發現只有在Chr1上的crtS 位點復制后才會觸發Chr2啟動。本研究提供了關于 crtS 如何觸發Chr2復制起始的新思路，對Chr1-Chr2復制協調機制進行了深入探討。

研究成果：

❶、crtS（位于Chr1上，啟動子結合位點）和39m位點（位于Chr2上，啟動子結合位點）通過與啟動子RctB競爭結合影響Chr2的復制，crtS的存在降低了RctB與39m的結合。

▲crtS 能夠抵消39m位點的抑制作用。Chr2復制起點 (ori2)和39m 位點的序列比對。RctB結合位點以綠色（iterons，啟動子結合位點）和紅色（39m）表示。

❷、RctB分為4個結構閾，研究發現其通過相同的DNA結合域與crtS和39m相互作用。進一步研究表明RctB域IV對于ori2（Chr2）起始位點的39m和crtS調節都是不可或缺的，并且RctB域IV的C端對于crtS協調兩條染色體的復制至關重要。

基于該調控模型，文章使用naica®微滴芯片式數字PCR系統（Stilla Technologies）對霍亂弧菌中的（ori1 /ori2）和對照大腸桿菌中的（oriC / pORI2）進行定量，同時使用naica®多重數字RT-dPCR (Stilla Technologies) 對來自指數生長培養物 (OD600 0.4) 的霍亂弧菌中的 RctB mRNA 進行了定量并證實了上述猜想的正確性。

▲B、 pORI2 相對于大腸桿菌菌株染色體的拷貝數 (CN)，通過在 rctB 中插入終止密碼子構建各種 pORI2缺失表達載體。C、在有和沒有染色體 crtS 位點 (+/- crtS)的情況下，大腸桿菌中 pORI2 拷貝數的比率。D、Chr2 在非復制型霍亂弧菌中相對于 Chr1 (ori2/ori1) 的拷貝數。在所有突變體中，crtS位點被敲除，RctB結合位點被插入 Chr1 的 attTn7 插入位點（平均值±標準偏差）。

最后文章解釋了霍亂弧菌的復制機制模型：

▲crtS 協調 Chr1 和 Chr2 之間復制的模型。RctB 結合位點以綠色 (iterons)、紅色 (39m) 和藍色 (crtS) 顯示。OFF = Chr1：crtS 未被復制。Chr2：與39m位點結合的RctB主要通過紅色箭頭所示來抑制ori2的復制起始。ON = Chr1：crtS 已復制。RctB與復制的crtS位點的瞬時結合導致與39m位點親和力降低（藍色箭頭），從而釋放ori2。RctB與甲基化iterons的結合導致DNA解旋元件 (DUE) 打開，RctB寡聚化到單鏈DNA上（綠色箭頭）。

期刊介紹：

Nucleic Acids Research (NAR)：1974年創刊，由牛津大學出版社經過同行評審公開出版的科學期刊。期刊主要發布涉及核酸代謝和/或相互作用的核酸和蛋白質的物理，化學，生化和生物學方面的前沿研究結果。最新影響因子16.971。