多重naica®數字PCR法在同時監測水質中多種細菌種類和計數的應用

導讀

在現代水產養殖中，水產養殖系統是為魚類或其他物種的集約養殖而設計，其水質直接影響魚類的健康和生產，而微生物在去除有機物和氮循環、有毒硫化氫(H₂S)的產生方面發揮著至關重要的作用，微生物種類和數量會直接影響魚類的健康，準確計數特定種類的細菌對控制潛在風險至關重要，尤其是那些對養殖魚類及其最終消費者具有致病性的細菌。因此亟需高精度、高特異性、高敏感性且快速的方法，監測特定種類的細菌和數量。

挪威海洋科技研究中心SINTEF Ocean科學家建立基于naica^®微滴芯片數字PCR系統的多重數字PCR絕對定量評估鮭魚三種關鍵病原體、人病原體單核增生李斯特菌、影響鮭魚生存環境的硫酸鹽還原菌(SRB)，用于水產養殖的相關優勢細菌進行監測。

該方法在發表于《Journal of Microbiological Methods》雜志上，題為“Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR”。

應用亮點：

▶  使用naica^®微滴芯片數字PCR系統直接絕對定量水產養殖系統中五種細菌。

▶  開發同時定量水產養殖水質檢測相關五種細菌的多重數字PCR檢測方法。

▶  基于naica^®微滴芯片數字PCR檢測方法具有靈敏度高、特異性高、耗時少的優勢。

科學家建立數字PCR方法監測與鮭魚養殖生產過程中三類不同的細菌：

第一類：魚類病原體，與魚類的潰瘍性疾病有關的粘放線菌Moritella viscosa，會引起腸性紅嘴病的魯氏耶爾森菌Yersinia ruckeri以及與魚類的細菌性冷水病有關的黃桿菌Flavobacterium psychrophilum。

第二類：人類病原體，可以從海產品轉移到消費者身上的人病原體，單核增生李斯特菌Listeria monocytogenes。

第三類：破壞魚類生長環境的細菌。通常硫酸鹽還原細菌（SRB）在厭氧條件下通過將硫酸鹽（SO42-）轉化為有毒的硫化氫（H2S）來影響魚類健康。可通過以脫硫弧菌Desulfovibrio desulfuricans為參考菌株進行SRB檢測。

研究學者利用naica^®微滴芯片數字PCR系統的單重和多重檢測方法對上述優勢菌種進行絕對定量。結果表明粘放線菌Moritella viscosa，魯氏耶爾森菌Yersinia ruckeri，黃桿菌Flavobacterium psychrophilum檢出限低至20fg，李斯特菌Listeria monocytogenes和脫硫弧菌Desulfovibrio desulfuricans DNA檢測含量可低至2fg，均具有更寬的線性范圍，線性擬合度R²均在0.999以上（圖1）。多重naica^®微滴芯片數字PCR系統檢測結果與單重分析中檢測到的目標基因濃度吻合（圖2，圖3）。此次研究充分證明了naica^®微滴芯片數字PCR系統可以同時精確定量復雜水質樣品中多種類細菌。

▲圖1：naica^®微滴芯片數字PCR系統定量5種細菌的線性回歸圖，分別給出相應的方程和回歸系數。

▲圖2：對魯氏耶爾森菌Yersinia ruckeri（A）黃桿菌Flavobacterium psychrophilum（B）的單、雙重分析結果進行比較。在MMC-DNA背景(1 ng/μl)中添加魯氏耶爾森菌Yersinia ruckeri ，黃桿菌Flavobacterium psychrophilum gDNA，10倍稀釋后進行基因拷貝數定量。

▲圖3：在1 ng/μl MMC-DNA背景下，單重(圓形)和三重(三角形)測定的靶基因拷貝濃度繪制。恒等線表示每個點的X坐標和y坐標相等的位置。
 

原文鏈接如下：http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

挪威海洋科技研究中心SINTEF Ocean為全球開展的海洋相關科學研究和創新，致力于海洋技術、生物標記和海洋環境技術研究。