線蟲顯微注射超詳細實驗步驟操作教程
秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)是研究動物遺傳、個體發育和行為活動的重要模式生物，能夠研究從分子細胞水平到整體系統水平的相關生命活動的作用機理。顯微注射技術使用尖端開口直徑為微米級的玻璃微管，將核酸注入線蟲的性腺，進而被成熟的卵細胞吸收，以染色體外遺傳物質的形式存在。而顯微注射技術是線蟲領域的核心技術，廣泛應用于研究線蟲的基因表達、功能和基因間的相互作用等。
（圖片來源于攝影師馬克奧-西奧卡）
實驗儀器及試劑
主要儀器包括：
顯微操縱器、拉制儀、注射泵、體式顯微鏡或倒置顯微鏡等。
試劑耗材包括：
瓊脂糖、礦物油、帶芯玻璃管、載玻片、拾取針、恢復緩沖液、OP50培養基、加樣針等。
實驗步驟
01、制備瓊脂糖固定板
移液槍取約50μl加熱溶解的2%瓊脂糖溶液滴在24mm×60 mm的載玻片上，用另一載玻片輕壓其上(小心氣泡產生)，待瓊脂糖凝固后(約5分鐘)，將上面的玻片從側面滑下即可。將制作好的瓊脂板室溫過夜或80℃干燥1小時后可疊放起來備用。
圖：瓊脂糖固定板的制備[1]。A. 用兩條膠帶將載玻片固定在干凈的工作臺上；B. 在載玻片中間滴一滴約50μl新鮮熱熔2% 瓊脂糖溶液；C. 將顯微鏡載玻片放在瓊脂糖滴上，輕輕按下使其變平。瓊脂糖凝固并取出顯微鏡載玻片。
02、制備注射針
注射針對于注射成功與否至關重要，使用水平拉制儀通過調節速度、拉力等參數可穩定獲得兩根相同的注射針，建議使用有芯玻璃管進行拉制，其芯能夠使注射液迅速充滿針頭尖端，可以很好的排出氣泡。注射針的錐度一般5-7mm，尖端0.5-0.9μm。
MP-500有著前衛智能的操作界面及加熱片限位槽等人性化設計，集安全性與人性化于一體，輕松滿足微電極相關實驗的需求。
03、制備注射液并加入注射針
根據實驗需求，選擇擬注射的物質，包括DNA、RNA、蛋白質等。注射物的純度是轉入效率高低的重要影響因素之一。通過注射針的尾端，用細長的加樣針將注射液灌入，等待數分鐘，觀察針尖有無氣泡。
04、注射體積校準
將注射針裝到注射泵上，吸入待注射液。在顯微鏡視野中心放一把微尺，上面放置一個裝適量礦物油的4厘米的培養皿。將注射針浸入礦物油中，注射一次得到一個液滴球，通過微尺測量球體直徑計算出注射的體積，調整注射液滴的大小使其符合所需的直徑。1 nL液滴的半徑為0.062 mm (V = 4/3πR3)。
瑞沃德R480玻璃微電極注射泵，注射精度高，運行穩定，密封性良好，保證注射過程不會出現漏液情況。
05、破針
將玻片放在加入注射油的瓊脂墊上，移動微操使注射針與玻片邊緣相撞，注射針尖端被撞破，可觀察到有液泡自動滲出，該方法更易于刺入線蟲體內。
06、固定線蟲
一般挑選即將產卵或體內有少量卵的年輕成蟲進行注射，此時期性腺發育成熟，較易被DNA 轉染從而產生轉基因后代。使用拾取針將線蟲挑至瓊脂糖固定墊上，調整位置使性腺暴露，滴加注射油覆蓋整個蟲體。固定操作要迅速，否則線蟲容易脫水而死。
圖：固定在固定板上并準備注射的線蟲。箭頭表示在性腺中注射首選部位。比例尺為50μm[1]。
07、注射
將瓊脂糖固定板放在載物臺上，顯微鏡下找到線蟲，調整焦距，將性腺部位聚焦在正確的平面。使用微操，將注射針尖刺入性腺。啟動微量注射泵進行注射，能觀察到注射液在性腺中快速流動，注射后的性腺被液體充滿。
圖：顯示注射物注射前(1)和注射后(2)的流動。箭頭標記性腺中的區域，注射物到達的位置[2]。
MM-500電動顯微操縱器與顯微鏡配合使用，可以完成人手不能從事的精細運動的顯微操作，體積小巧輕便，人性化中英文操作界面，操作起來更便捷。
08、恢復
在體視顯微鏡下，滴加恢復緩沖液至注射后的線蟲。一般等待2-5 min，線蟲活力恢復，即頭部左右搖擺，身體開始游動，即可挑至培養板上，進行20℃常規培養。
瑞沃德提供MP-500程控水平電極拉制儀、MM-500電動顯微操縱器、R480玻璃微電極注射泵組合方案，可對斑馬魚、線蟲等胚胎、幼體進行超精細顯微注射。
瑞沃德注射系統
注意事項[2]：
a．瓊脂糖固定板：若線蟲在瓊脂糖固定板上短時間內死亡，則說明固定板過于干燥，可換瓊脂糖層稍薄的固定墊，因為瓊脂糖的主要作用是吸收線蟲的水分；若線蟲無法粘牢，則說明固定墊太濕或太薄，可繼續在烘箱內放一段時間，或將線蟲先粘在固定墊上后加油；
b．注射物質：注射DNA使用前要混勻并離心以避免雜質阻塞針頭。注射DNA的總濃度一般控制在200mg/L以下，因為較高濃度的DNA可能產生毒性或過量表達，從而影響下一代的表型恢復；
c．注射角度：注射針與性腺最好呈銳角，推薦與頭部或尾部幾乎平行或呈15℃角；
d．實驗樣本：被注射的線蟲需要保證其食物充足，生長狀態健康；
f．注射后線蟲死亡率高：注射后等待恢復的時間過短或太長；可能是注射針尖太粗或注射DNA 被污染。針對此原因，可使用較細注射針，每次只注射一側性腺，若注射操作正確，但不產生轉基因線蟲，則可能是轉基因致死或注射核酸污染，可重新純化。
【參考文獻】
[1] Matthias Rieckher and Nektarios Tavernarakis. Generation of Caenorhabditis elegans Transgenic Animals by DNA Microinjection [J].Bio Protocol, 2017, 7(19): e2565.
[2] Krishna S. Ghanta et al., Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans[J].Star Protocols, 2021, 2(3): 100748.
