數字PCR在華盛頓大學監測HIV病毒和SARS-CoV-2感染研究的應用
COVID-19大流行中斷了對艾滋病病毒感染者的常規護理，嚴重影響了對艾滋病病毒感染者的診斷和治療。如果感染SARS-CoV-2, 艾滋病病毒感染者的發病率和死亡率會增加。據報道，近日在南非發現新冠新型變異毒株Omicron可能由艾滋患者體內進化而來。因此密切監測HIV血漿病毒載量（VL）并篩查SARS-COV-2感染就顯得尤為迫切。近日，來自華盛頓大學的Gaurav K Gulati和Nuttada Panpradist等科學家在medRxiv平臺上提交文章《Inexpensive workflow for simultaneous monitoring of HIV viral load and detection of SARS-CoV-2 infection》的預印本。
通過開發一種新的工作流程，同時定量艾滋病毒載量和檢測SARS-CoV-2。文中使用naica®微滴芯片數字PCR系統對RNA濃度進行精準定量，用于新方案的評估。
文章中作者基于Boom方法開發了一種內部RNA提取方法，從血漿、鼻腔分泌物（NS）或二者混合物中進行RNA提取，對HIV長末端重復序列（LTR） 、SARS-CoV-2核衣殼基因區域（N1、N2）和人類核糖核酸酶 P(RP)進行RT-qPCR分析，估計血漿病毒載量并對HIV/SARS-CoV-2狀態進行分類（HIV為病毒學失敗或抑制，SARS-CoV-2為陽性、假定陽性、陰性或不確定）。
首先，作者將包含HIV LTR檢測擴增區域或N1/N2檢測的DNA片段作為RNA生成的起始DNA構建體。使用 T7 RNA聚合酶將DNA構建體轉化為RNA。為了對體外轉錄的RNA濃度進行精準定量，作者使用naica®微滴芯片數字PCR系統對RNA濃度進行絕對定量（圖1）。從圖中可以看出通過檢測OD值并不能對RNA濃度進行精準定量，因此最終利用數字PCR的結果對RNA的濃度進行了校正。
圖1:數字PCR量化體外轉錄的RNA標準濃度
隨后將合成的不同濃度的HIV RNA與血漿樣本進行混合構成人造血漿樣本，合成的不同濃度的SARS-CoV-2 RNA與NS進行混合構成人造NS樣本，分別采用內部提取方法和標準提取方法對血漿樣本中HIV、NS樣本中SARS-CoV-2和血漿和NS混合樣本中HIV和SARS-CoV-2進行靈敏度檢測。同時采用133個臨床樣本，其中40個血漿樣本（30個HIV血清陽性），67個NS樣本（31個SARS-CoV-2陽性）和26個血漿和NS混合樣本（26個HIV陽性，10個SARS-CoV-2陽性）進行評價（圖2）。
結果表明：內部提取對HIV的檢測限為200拷貝/mL，對SARS-CoV-2的檢測限為100拷貝/mL。對于血漿樣本，兩種方法測量的HIV病毒載量水平呈正相關（人造樣本的R2：0.98, 臨床樣本R2: 0.81）。在對NS樣本使用內部提取方法時，排除不確定結果，與標準提取方法相比，95%的一致性（25個陽性，6個假定陽性和31個陰性）。對于血漿和NS混合樣本，兩種方法測量的HIV病毒載量水平呈正相關（人造樣本的R2：0.98, 臨床樣本R2: 0.71）。SARS-CoV-2檢測結果顯示陽性和陰性分類是100%一致性。
圖2：使用兩種不同提取方法從血漿和NS混合樣本中共同提取的RNA中獲得的HIV LTR 和SARS-CoV-2 Cq值的比較.（a）比較標準與內部提取方法性能的實驗設計方案。（b）來自內部提取方法的SARS-CoV-2 LTR、N1、N2和人 RP （陰性樣本的對照）測定的Cq值。（c）基于兩種提取方法的結果對樣本進行分類。通過兩種方法提取的樣本中測得的（d）LTR、（e）N1和（f）N2的散點圖。
綜上所述，作者開發的內部提取方法可以從單獨的血漿或血漿和NS混合樣本提取RNA來確定艾滋病病毒感染者是否存在SARS-CoV-2感染，從而有可能簡化HIV管理和SARS-CoV-2檢測。將這兩種病毒的檢測結合起來可以有效的減少COVID-19對艾滋病毒治療的影響。
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原文：https://doi.org/10.1101/2021.08.18.21256786
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