naica®數(shù)字PCR系統(tǒng)在高通量測定大麥花粉核減數(shù)分裂重組率的應(yīng)用

減數(shù)分裂通過產(chǎn)生單倍體細(xì)胞和基于同源重組（HR）產(chǎn)生的遺傳變異來支持有性生殖。HR通過重組交換(CO)、同源染色體之間的聯(lián)會，交換等來確保減數(shù)分裂染色體分離，同時保證遺傳變異在育種過程中發(fā)揮作用。
 

在植物中，同源重組可以通過幾種技術(shù)檢測到，例如通過減數(shù)分裂染色體分析進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢測，通過測序進(jìn)行基因分型和分離群體中的分子標(biāo)記或熒光標(biāo)記株系（FTLs）。FTLs在擬南芥中是測量花粉或種子中減數(shù)分裂重組事件的有力工具。但FTLs不適用于作物，因?yàn)樵诨�因組特別大的作物中產(chǎn)生FTLs既費(fèi)力又昂貴。此外，不同的作物或某些基因型不適合遺傳轉(zhuǎn)化。作為替代，使用小孢子(四分體或花粉核)基因分型或測序用于直接檢測減數(shù)分裂產(chǎn)物中減數(shù)分裂重組的結(jié)果。然而，作物小孢子的測序/基因分型相當(dāng)昂貴，因此可以進(jìn)行檢測的數(shù)量有限，特別是對于大基因組物種如谷物。
 

在受精前測量雄配子的減數(shù)分裂重組率有樣本量大，分子標(biāo)記分析獨(dú)立和即時重組交換分析的優(yōu)勢，但配子DNA含量有限，測序/基因分型方法通常依賴于全基因組擴(kuò)增(WGA)。而直接通過PCR反應(yīng)分析單個配子進(jìn)行基因分型也由于單倍體配子的低DNA含量無法達(dá)成。在大麥中，單花粉核基因分型是通過熒光激活細(xì)胞分選從種內(nèi)雜種中分離出單個單倍體花粉核，然后進(jìn)行WGA和多位點(diǎn)KASP基因分型或單細(xì)胞基因組測序完成的。單個單倍體花粉核的DNA有限，且WGA價格較高，導(dǎo)致分析樣品的數(shù)量有限，無法完成高通量的分析。
 

德國萊布尼茨植物遺傳和作物植物研究所的科學(xué)家近日在《The Plant Journal》上發(fā)表了一篇減數(shù)分裂重組率測量的相關(guān)文獻(xiàn)，該文章采用naica®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對配子中減數(shù)分裂重組率進(jìn)行測量，實(shí)現(xiàn)高通量和低成本的基因分型。

使用基于naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的基因分型分析，無需大量預(yù)先進(jìn)行的WGA就可完成對大麥花粉細(xì)胞核中減數(shù)分裂重組率的高通量測量。在取得花粉后，將花粉中的花粉核取出，并通過流式進(jìn)行純化，將得到的花粉核加入naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的Mix中進(jìn)行檢測，從而得到減數(shù)分裂重組率，通過對總共>42，000個單個花粉核進(jìn)行基因分型(每株分析多達(dá)4900個核)，在雜交植物中測量了兩個著絲粒和兩個遠(yuǎn)染色體間隔內(nèi)的減數(shù)分裂重組率。花粉核中確定的重組頻率與分離群體中的檢測到的頻率接近。
 

▲ 圖1：用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)進(jìn)行大麥單花粉核基因分型的工作流程。（a）雜交植物的花藥；(b)通過使用不同篩孔大小的過濾器(100和20微米)在懸浮液中分離花粉和花粉核。(c)花粉核用碘化丙錠染色，并流式分選到數(shù)字PCR反應(yīng)Mix中。(d)將25微升數(shù)字PCR反應(yīng)Mix(包括分選的花粉核)裝入sapphire芯片的四個腔室之一。(e)在Geode中進(jìn)行液滴生成和熱循環(huán)。(f)在熱循環(huán)之后，在naica^® Prism 3中掃描sapphire芯片，然后在Crystal Miner軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)分析

該文章在進(jìn)行花粉核減數(shù)分裂重組率的檢測時采用雙探針法，如前期可行性驗(yàn)證時檢測的InDel3118和InDel3135之間的區(qū)間Id 3-1，用HEX標(biāo)記Barke (B)等位基因特異性探針(綠色)，用FAM標(biāo)記Morex (M)等位基因特異性探針(藍(lán)色)(圖2b)，研究者將來自親本基因型的花粉核以1∶1的比例混合，同時也檢測了Id 3-1雜合的雜交植物的花粉核。在親本混合樣本檢測中，兩種親本基因型的液滴相等，兩種標(biāo)記顯示相同的熒光(B的HEX或M的FAM)(圖2b)。在雜交材料樣本檢測中下，預(yù)計(jì)會出現(xiàn)代表重組事件的不同液滴群，即同時顯示兩種顏色的液滴(InDel3118為HEX，InDel3135為FAM，反之亦然)(圖2b)。在實(shí)際檢測中發(fā)現(xiàn)，親代基因型得到了數(shù)量大致相等的液滴，它們對兩種標(biāo)記物顯示出相同的熒光(圖2d，e，綠色和藍(lán)色矩形)。在對雜交植物的花粉核的檢測中，檢測到具有兩種顏色(HEX和FAM)的液滴，表明重組事件(圖2e，紅色矩形)。此外，可以區(qū)分只有一個標(biāo)記成功擴(kuò)增的液滴(圖2d，e，簇I和iii)以及沒有任何擴(kuò)增的液滴(圖2d，e，簇ii)。表明使用naica®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對單個花粉核進(jìn)行包裹和基因分型是完全可行的。
 

▲ 圖2。用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)進(jìn)行大麥花粉單核基因分型。(a)在大麥染色體1和3上定義四個染色體間隔的的InDel或單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記。(b)以Id 3-1為例的基于naica®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的花粉核基因分型分析:兩種熒光探針的可能組合能夠區(qū)分重組和非重組花粉核。（c）有效微滴陣列原始視圖。每個腔室通常包含大約25000個穩(wěn)定的有效液滴。在任何通道(FAM或HEX)中成功擴(kuò)增的液滴是淺灰色的，而暗灰色的液滴是陰性的。(d，e)來自芯片室的基于naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的花粉核基因分型數(shù)據(jù)，在軟件中顯示為來自以1:1比例混合的親本基因型的花粉核的點(diǎn)圖(d)和來自與Id 3-1雜合的雜交植物的花粉核的點(diǎn)圖。(e)通過兩個HEX標(biāo)記的(綠色方框)或FAM標(biāo)記的等位基因探針(藍(lán)色方框)將兩個非重組親代群體檢測為具有成功基因分型的微滴。在親代基因型混合物(d)的點(diǎn)狀圖中以灰色框表示HEX和FAM雙陽性微滴為假陽性+噪聲。雜交植物中HEX和FAM雙陽性微滴為包括假陽性和噪音在內(nèi)的重組群體，顯示為紅色方框(e)。簇(I)和(iii)代表僅成功擴(kuò)增一種標(biāo)記的微滴

naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)具有極高的分辨率，因此在那些成功擴(kuò)增標(biāo)記物的微滴中，也可以觀察到微滴內(nèi)的細(xì)胞核(圖2c)，研究者通過對微滴包裹核的數(shù)量分析進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，通過用熱穩(wěn)定的限制性酶預(yù)處理花粉核來提高基因分型的效率，且因?yàn)榧?xì)胞核數(shù)量與單個包裹細(xì)胞核的微滴數(shù)量呈正相關(guān)，提出上樣細(xì)胞核的最佳區(qū)間（不同物種的不同大小細(xì)胞核有差異）。
 

本文基于2色探針進(jìn)行檢測是非常成功的，而進(jìn)一步通過6色平臺可以同時進(jìn)行更多組基因分型檢測，將獲得多重基因分型數(shù)據(jù)，也可以對相同或不同染色體上的一個以上染色體間隔的重組率進(jìn)行平行測量，或者對CO干擾強(qiáng)度/存在的測量。
 

總的來說，基于naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的單個大麥花粉核基因分型在種內(nèi)雜種植物的規(guī)定染色體間隔內(nèi)提供了可靠、快速和高精度的減數(shù)分裂重組測量。來自一系列具有不同細(xì)胞核和基因組大小的物種的細(xì)胞核的成功包裹表明，所提出的方法廣泛適用于單個細(xì)胞核的基因分型。
 

德國萊布尼茨植物遺傳與作物研究所(IPK)的Stefan Heckmann教授和Yun-Jae Ahn博士也給我們在線分享了他們的研究成果，想要直觀的去了解這篇文章的詳細(xì)內(nèi)容，請點(diǎn)擊https://mp.weixin.qq.com/s/KNXVs6rOt8MYpBjzuKZZ9A進(jìn)行觀看哦。
 

本文鏈接：https://doi: 10.1111/tpj.15305

naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)，自動化微滴生成和擴(kuò)增，每個樣本孔可實(shí)現(xiàn)6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進(jìn)行質(zhì)控，3小時內(nèi)即可獲得至少6個靶標(biāo)基因的絕對拷貝數(shù)濃度。