從樣本制備和轉(zhuǎn)印過(guò)程提高western blot的準(zhǔn)確性

適當(dāng)的樣本準(zhǔn)備

樣品準(zhǔn)備不當(dāng)，會(huì)讓你頭疼不已，當(dāng)準(zhǔn)備裂解液時(shí)：

• 快速工作
• 保持低溫環(huán)境
• 增加蛋白酶
• 進(jìn)行分裝，避免反復(fù)凍融

如果要分裝樣品，請(qǐng)確保等量分裝，以便檢查是否在此過(guò)程中丟失了目標(biāo)。 如果您分離的樣品濃度非常低，請(qǐng)記住，使用高靈敏度底物和較少的裂解液。
如果你的裂解液中含有大量的DNA，它就會(huì)變得粘稠。 大量的DNA會(huì)使樣品難以移液，并且可能會(huì)在凝膠上產(chǎn)生條紋或污跡。 如果是這種情況，請(qǐng)確保在添加上樣緩沖液之前將DNA酶添加到裂解液中。
對(duì)于變性凝膠，不要忘記在電泳前將樣品在98°C加熱5分鐘。 這樣可以使樣品完全變性并確保得到干凈銳利的條帶。
 
一些技巧可供參考：
使用過(guò)濾后的緩沖液，在電泳前仔細(xì)檢查緩沖液，以確保緩沖液不會(huì)隨著時(shí)間的推移而沉淀。
當(dāng)取下凝膠梳子時(shí)，請(qǐng)非常緩慢地進(jìn)行，以免孔塌陷或扭曲。
使用上樣器進(jìn)行上樣。 在上樣時(shí)，確保將尖端盡可能靠近孔的底部，緩慢的加入樣品，同時(shí)小心地將上樣器取出。
在每個(gè)孔中加載相同的體積，不要空位。
低電壓慢跑，特別是最初濃縮樣品時(shí)。
·    電泳完成后，使用干凈的刀片切除凝膠的孔和底部凝膠。 這些會(huì)導(dǎo)致輕微的高度差異，可能會(huì)干擾轉(zhuǎn)印。

轉(zhuǎn)印

轉(zhuǎn)印是將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到膜上的過(guò)程。

• 確保“三明治”的所有材料尺寸相同。 濾紙，膜和凝膠都應(yīng)該是完美的選擇。 這樣可以防止討厭的氣泡出現(xiàn)在你的膜上。
• 從膠板中取出凝膠時(shí)，不要拉伸凝膠。 用刀片從凝膠上取下底部和孔后，在凝膠上放置幾片預(yù)先濕潤(rùn)的濾紙，輕輕地將其弄平。 濾紙將作為支撐，小心地剝離凝膠。

·    確保圓形工具驅(qū)趕氣泡。 動(dòng)作要輕柔，以免扭曲凝膠。

有很多事情可以在這里出錯(cuò)。
選擇適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)化策略。 讓我們面對(duì)現(xiàn)實(shí)，無(wú)論你多么小心，都可能會(huì)得到一個(gè)有缺陷的凝膠或膜，這將毀了你的一天實(shí)驗(yàn)。 但是，如果您使用總蛋白質(zhì)染色或加載對(duì)照抗體來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化您的數(shù)據(jù)，您可以挽救您的實(shí)驗(yàn)。例如使用AzureRed總蛋白染色劑，兼容下游western blot實(shí)驗(yàn)，配合sapphire 雙模式多光譜成像系統(tǒng)，可進(jìn)行多重?zé)晒鈾z測(cè)，定量更準(zhǔn)確，使用更方便。
確保目標(biāo)和內(nèi)參具有相同的線性范圍。 化學(xué)發(fā)光是半定量成像，避免飽和尤其重要。
選擇經(jīng)過(guò)充分驗(yàn)證并在文獻(xiàn)中引用的高質(zhì)量一抗。
使用合適的底物以避免信號(hào)飽和。 Azure為您提供Radiance和Radiance plus化學(xué)發(fā)光底物，以滿足您的所有靈敏度需求。
考慮合適的背景去除方法，準(zhǔn)確定量條帶。
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